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DNA提取方法簡(jiǎn)介DNA提取的幾種方法基因組DNA的提取CTAB法SDS法其它DNA提取的幾種方法非基因組DNA的提取質(zhì)粒DNA的提取?堿裂解法?煮沸法線(xiàn)粒體、葉綠體DNA的提取?差速離心結合SDS裂解法基因組DNA-CTAB法CTAB法原理(植物DNA提取經(jīng)典方法)CTAB(,十六烷基三甲基溴化銨),是一種陽(yáng)離子去污劑,可溶解細胞膜,并與核酸形成復合物。具有從低離子強度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性,在這種條件下,蛋白質(zhì)和中性多聚糖仍留在溶液里該復合物在高鹽溶液中(>0.7mol/LNaCl)是可溶的,通過(guò)有機溶劑抽提,去除蛋白、多糖、酚類(lèi)等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來(lái)。植物材料之前必須預熱,且離心時(shí)溫度不要低于15℃。注:CTAB溶液在低于15℃時(shí)會(huì )形成沉淀析出,因此在將其加入冰冷的基因組DNA-CTAB法CTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方組份終濃度Tris-HClEDTANaCl(pH8.0)(pH8.0)100mM20mM1.4MCTAB2%(W/V)β-巰基乙醇0.1%(V/V)使用前加入Tris-HCl(pH8.0)提供一個(gè)緩沖環(huán)境,防止核酸被破壞;EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子,抑制DNase活性;NaCl提供一個(gè)高鹽環(huán)境,使DNP(脫氧核糖核蛋白)。CTAB溶解細胞膜,并結合核酸,使核酸便于分離;β-巰基乙醇是抗氧化劑,有效地防止酚氧化成醌,避免褐變,使酚容易去除基因組DNA-CT
DNA提取的幾種方法
(1).濃鹽法
利用RNP和DNP在電解溶液中溶解度不同,將二者分離,常用的方法是用1M 氯 納提取化鈉抽提,得到的DNP粘液與含有少量辛醇的 氯仿一起搖蕩,使乳化,再離心除去蛋白質(zhì),此時(shí)蛋白質(zhì)凝膠停留在水相及氯仿相中間,而DNA位于上層水相中,用2倍體積95%乙醇可將DNA 鈉鹽沉淀出來(lái).
也可用0.15 MNaCL液反復洗滌細胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脫氧核糖蛋白,再按氯仿---異醇法除去蛋白.
兩種方法比較,后種方法使核酸降解可能少一些.
以稀鹽酸溶液提取DNA 時(shí),加入適量去污劑,如SDS可有助于蛋白質(zhì)與DNA 的分離.在提取過(guò)程中為抑制組織中的DNase對DNA 的降解作用,在氯化鈉溶液中加入檸檬酸鈉作為金屬離子的烙合劑.通常用.15MNaCL,0.015M檸檬鈉,并稱(chēng)SSC溶液,提取DNA.
(2).陰離子去污劑法:
用SDS或二甲苯酸鈉等去污劑使蛋白質(zhì)變性,可以直接從生物材料中提取DNA .由于細胞中DNA與蛋白質(zhì)之間常借靜電引力或配位鍵結合,因為陰離子去污劑能夠破壞這種價(jià)鍵,所以常用陰離子去污劑提取DNA.
(3).苯酚抽提法:
苯酚作為蛋白變性劑,同時(shí)抑制了DNase的降解作用.用苯酚處理勻漿液時(shí),由于蛋白與DNA 聯(lián)結鍵已斷,蛋白分子表面又含有很多極性基團與苯酚相似相溶.蛋白分子溶于酚相,而DNA溶于水相.離心分層后取出水層,多次重復操作,再合并含DNA 的水相,利用核酸不溶于醇的性質(zhì),用乙醇沉淀DNA .此時(shí)DNA是十分粘稠的物質(zhì),可用玻璃漫漫繞成一團,取出.此法的特點(diǎn)是使提取的DNA保持天然狀態(tài) .
( 4).水抽提法:
利用核酸溶解于水的性質(zhì),將組織細胞破碎后,用低鹽溶液除去RNA,然后將沉淀溶于水中,使DNA充分溶解于水中,離心后收集上清液.在上清中加入固體氯化鈉調節至2.6M.加入2倍體積95%乙醇,立即用攪拌法攪出.然后分別用66% 80%和95%乙醇以及丙銅洗滌,最后在空氣中干燥,既得DNA樣品.此法提取的DNA中蛋白質(zhì)含量較高,故一般不用.為除蛋白可將此法加以改良,在提取過(guò)程中加入SDS.
原理就是去掉植物細胞壁 細胞膜 質(zhì)體 線(xiàn)粒體 葉綠體 剩下細胞核了。就是DNA了。
通常采用機械研磨的方法破碎植物的組織和細胞,由于植物細胞勻漿含有多種酶類(lèi)(尤其是氧化酶類(lèi))對DNA的抽提產(chǎn)生不利的影響,在抽提緩沖液中需加入抗氧化劑或強還原劑(如巰基乙醇)以降低這些酶類(lèi)的活性。在液氮中研磨,材料易于破碎,并減少研磨過(guò)程中各種酶類(lèi)的作用。
十二烷基肌酸鈉(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化銨(hexadyltrimethyl ammomum bromide,簡(jiǎn)稱(chēng)為CTAB)、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,簡(jiǎn)稱(chēng)SDS)等離子型表面活性劑,能溶解細胞膜和核膜蛋白,使核蛋白解聚,從而使DNA得以游離出來(lái)。再加入苯酚和氯仿等有機溶劑,能使蛋白質(zhì)變性,并使抽提液分相,因核酸(DNA、RNA)水溶性很強,經(jīng)離心后即可從抽提液中除去細胞碎片和大部分蛋白質(zhì)。上清液中加入無(wú)水乙醇使DNA沉淀,沉淀DNA溶于TE溶液中,即得植物總DNA溶液
脫氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid,DNA)是一切生物細胞的重要組成成分,主要存在于細胞核中,鹽溶法是提取DNA的常規技術(shù)之一。從細胞中分離得到的DNA是與蛋白質(zhì)結合的DNA,其中還含有大量RNA,即核糖核蛋白。如何有效地將這兩種核蛋白分開(kāi)是技術(shù)的關(guān)鍵。DNA不溶于0.14mol/L 的NaCl溶液中,而RNA則能溶于0.14mol/L 的NaCl溶液之中,利用這一性質(zhì)就可以將二者從破碎細胞漿液中分開(kāi)。制備過(guò)程中,細胞破碎的同時(shí)就有Dnase釋放到提取液中,使DNA因被降解而影響得率,在提取緩沖液中加入適量的檸檬酸鹽和EDTA,既可抑制酶的活性又可使蛋白質(zhì)變性而與核酸分離,再加入陰離子去垢劑0.15%的SDS,經(jīng)過(guò)2h攪拌,或用氯仿-異醇除去蛋白,通過(guò)離心使蛋白質(zhì)沉淀而除去,得到的是含有核酸的上清液。然后用95%的預冷乙醇即可把DNA從除去蛋白質(zhì)的提取液中沉淀出來(lái)。
生物幫上面有這方面的詳細介紹,多肽產(chǎn)品
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