pcr反應(yīng)(PCR操作時注意事項)
1.PCR操作時注意事項
1. PCR引物設(shè)計：
引物設(shè)計可能是PCR擴增成功最關(guān)鍵的因素。如引物設(shè)計欠佳，可能導(dǎo)致擴增產(chǎn)物不足，甚至擴增失敗，其原因是設(shè)計欠佳的引物可導(dǎo)致非特異擴增和/或形成引物二聚體，此又成為PCR反應(yīng)的競爭性產(chǎn)物，從而進一步抑制PCR產(chǎn)物形成。
在引物設(shè)計時必須考慮以下幾個因素，其中最重要的是引物長度、溶解溫度（Tm）、特異性、引物序列互補問題、G/C 含量和多嘧啶（T,C） 或多嘌呤（A, G）延伸、3'-末端序列等。
(1)引物長度：由于PCR反應(yīng)的特異性、退火溫度以及時間均至少部分與PCR引物長度相關(guān)聯(lián)，因此引物長度是PCR擴增是否成功關(guān)鍵的因素。一般PCR引物長度為15-30核苷酸。
(2)溶解溫度（Tm）：因加熱而斷開H鍵，使雙鏈DNA分開或“溶解”為單鏈DNA。溶解溫度（Tm）即指使一半雙鏈DNA變?yōu)閱捂淒NA的溫度。Tm可采用下列公式計算：Tm=2(A+T) + 4(G+C)。
需注意PCR反應(yīng)至少有兩個（一對）引物，兩個寡核苷酸引物Tm 值應(yīng)比較接近，不可差異過大。因有較高的Tm值的引物在較低的反應(yīng)溫度時可發(fā)生錯配，而引物Tm值較低，反應(yīng)溫度較高時則可能不能發(fā)生作用，因此如引物的Tm值差異較大，可導(dǎo)致PCR擴增效率低下甚至擴增失敗。
(3)引物序列互補：設(shè)計引物時應(yīng)絕對沒有3個堿基以上的內(nèi)引物配對，如引物有這樣具有自我配對的區(qū)域，“彈回”即部分雙鏈結(jié)構(gòu)將發(fā)生在退火反應(yīng)時。
(4)G/C 含量和多嘧啶（T,C） 或多嘌呤（A, G）延伸：待選擇的引物序列應(yīng)盡可能是堿基隨意分布，G+C含量平均-避免長A+T和富含G+C的區(qū)域。在引物的堿基組成中GC含量一般為45%-55%。在選擇的引物序列中應(yīng)沒有多G 或多C延伸，因其可促進非特異性退火，多A 和多T延伸也應(yīng)避免，因其可“呼吸”和使引物-模板復(fù)合物展開延伸，降低擴增的效率。同時多嘧啶（T,C）和多嘌呤（A,G）延伸也應(yīng)被避免。
(5)3'-末端序列：為控制引物錯配，應(yīng)認(rèn)真地確定PCR引物中3'末端的位置。
總而言之，應(yīng)重視PCR引物設(shè)計，設(shè)計PCR引物時應(yīng)認(rèn)真小心。對于一個成功的PCR來說，幾個重要因素如引物長度、GC含量和3'序列必須優(yōu)化。理想的引物應(yīng)為差不多隨意分布的核苷酸混合、GC含量50%、長度約為20個堿基，因此能使Tm值處于56-62oC范圍。分析靶基因潛在引物位點時，應(yīng)考慮無單聚合體， 沒有明顯的二級結(jié)構(gòu)形成的傾向，不自我互補，與其他雙鏈靶基因序列沒有明顯的同源性。為避免枯燥無味的設(shè)計，節(jié)省時間，減少錯誤，可應(yīng)用計算機程序優(yōu)化設(shè)計、選擇、確定寡核苷酸引物。
2.PCR的操作注意事項
實驗操作注意事項：盡管擴增序列的殘留污染大部分是假陽性反應(yīng)的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。因此，不僅要在進行擴增反應(yīng)是謹(jǐn)慎認(rèn)真，在樣品的收集、抽提和擴增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)該注意：
(1)戴一次性手套，若不小心濺上反應(yīng)液，立即更換手套。
(2)使用一次性吸頭，嚴(yán)禁與PCR產(chǎn)物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染。
(3)避免反應(yīng)液飛濺，打開反應(yīng)管時為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應(yīng)立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面。
(4)操作多份樣品時，制備反應(yīng)混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應(yīng)的精確度。
(5)最后加入反應(yīng)模板，加入后蓋緊反應(yīng)管。
(6)操作時設(shè)立陰陽性對照和空白對照，即可驗證PCR反應(yīng)的可靠性，又可以協(xié)助判斷擴增系統(tǒng)的可信性。
(7)盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器最容易受產(chǎn)物氣溶膠或標(biāo)本DNA的污染，最好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過程中加樣器應(yīng)該專用，不能交叉使用，尤其是PCR產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區(qū)。
(8)重復(fù)實驗，驗證結(jié)果，慎下結(jié)論。
3.簡述建立pcr反應(yīng)體系時需注意哪些問題
標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系：10*擴增緩沖液 10ul
4種dNTP混合物 各200umol/L
引物 各10~100pmol
模板DNA 0.2ug
Taq DNA聚合酶 2.5u
Mg2+ 1.5mmol/L
加雙或三蒸水至 100ul PCR反應(yīng)五要素：參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 引物：引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度.理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增.設(shè)計引物應(yīng)遵循以下原則：①引物長度：15-30bp，常用為20bp左右.②引物擴增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段.③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶.ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列.④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴增條帶.⑤引物3'端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗.⑥引物中有或能加上合適的酶切位點，被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處.⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性
希望有所幫助
4.在PCR擴增實驗中應(yīng)注意什么?
PCR產(chǎn)物的電泳檢測時間 一般為48h以內(nèi)，有些最好于當(dāng)日電泳檢測，大于48h后帶型不規(guī)則甚致消失。
假陰性，不出現(xiàn)擴增條帶 PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量及， ④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進行分析研究。
模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質(zhì)沒有消 化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。⑤模 板核酸變性不徹底。
在酶和引物質(zhì)量好時，不出現(xiàn)擴增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處 理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng) 固定不宜隨意更改。 酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導(dǎo)致假陰性。
需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。 引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不 理想、容易彌散的常見原因。
有些批號的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度 高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：①選定一個好的引物合成單 位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。
如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。
④引物設(shè)計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。 Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特 異性，濃度過低則影響PCR擴增產(chǎn)量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。
反應(yīng)體積的改變：通常進行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul?；?00ul，應(yīng)用多 大體積進行PCR擴增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul 后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。
物理原因：變性對PCR擴增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現(xiàn)假陰性；退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。
靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。 假陽性 出現(xiàn)的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。
引物設(shè)計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。
需重新設(shè)計引物。 靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。
這種假陽性可用以下方法解決：操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。
所用離心管及樣進槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。
二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇樱c引物互補后，可擴增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。
出現(xiàn)非特異性擴增帶 PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶 與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。
二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù) 過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶 則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。
其對策有：必要時重新設(shè)計引 物。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。
降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次 數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點法（93℃變性，65℃左右退火與延伸）。
出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶 PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量 差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。
其對策有：減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。
適當(dāng)降低Mg2+濃 度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。
5.PCR實驗過程中的注意事項
PCR產(chǎn)物的電泳檢測時間 一般為48h以內(nèi)，有些最好于當(dāng)日電泳檢測，大于48h后帶型不規(guī)則甚至消失。
PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量及， ④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進行分析研究。
酶切分析： 根據(jù)PCR產(chǎn)物中限制性內(nèi)切酶的位點，用相應(yīng)的酶切、電泳分離后，獲得符合理論的片段，此法既能進行產(chǎn)物的鑒定，又能對靶基因分型，還能進行變異性研究。 分子雜交：分子雜交是檢測PCR產(chǎn)物特異性的有力證據(jù)，也是檢測PCR 產(chǎn)物堿基突變的有效方法。
Southern印跡雜交： 在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈（內(nèi)部寡核苷酸）標(biāo)記后做探針，與PCR產(chǎn)物雜交。此法既可作特異性鑒定，又可以提高檢測PCR產(chǎn)物的靈敏度，還可知其分子量及條帶形狀，主要用于科研。
斑點雜交： 將PCR產(chǎn)物點在硝酸纖維素膜或尼膜薄膜上，再用內(nèi)部寡核苷酸探針雜交，觀察有無著色斑點，主要用于PCR產(chǎn)物特異性鑒定及變異分析。 氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀 核酸。
提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)。一般臨床檢測標(biāo)本，可采用快速簡便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴增。
RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。 溫度與時間的設(shè)置： 基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個溫度點。
在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點法，雙鏈DNA在90~95℃變性，再迅速冷卻至40 ~60℃，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至70~75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因（長度為100~300bp時）可采用二溫度點法， 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸（此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性）。
實驗操作注意事項 盡管擴增序列的殘留污染大部分是假陽性反應(yīng)的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。因此，不僅要在進行擴增反應(yīng)是謹(jǐn)慎認(rèn)真，在樣品的收集、抽提和擴增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)該注意： 1. 戴一次性手套，若不小心濺上反應(yīng)液，立即更換手套； 2. 使用一次性吸頭，嚴(yán)禁與PCR產(chǎn)物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染； 3. 避免反應(yīng)液飛濺，打開反應(yīng)管時為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體于管底。
若不小心濺到手套或桌面上，應(yīng)立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面； 4. 操作多份樣品時，制備反應(yīng)混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應(yīng)的精確度； 5. 最后加入反應(yīng)模板，加入后蓋緊反應(yīng)管； 6. 操作時設(shè)立陰陽性對照和空白對照，即可驗證PCR反應(yīng)的可靠性，又可以協(xié)助判斷擴增系統(tǒng)的可信性； 7. 盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器最容易受產(chǎn)物氣溶膠或標(biāo)本DNA的污染，最好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過程中加樣器應(yīng)該專用，不能交叉使用，尤其是PCR產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區(qū)； 8. 重復(fù)實驗，驗證結(jié)果，慎下結(jié)論。
6.PCR擴增需要注意的點
1. 引物的質(zhì)量是保證PCR特異性的關(guān)鍵，引物過長或過短均會使特異性降低，以18~30bp為宜；引物中C+G含量宜在50%左右；引物內(nèi)部和引物之間不應(yīng)含有互補序列；引物的堿基順序與非擴增區(qū)域的同源性應(yīng)小于70%；引物的3'末端與模板DNA一定要配對，但末端沒有嚴(yán)格的限制，故引物設(shè)計時可在5'末端加上限制性內(nèi)切酶位點和/或啟動密碼ATG等；引物合成后必須純化以去除合成產(chǎn)物中的不完整序列、脫嘌呤產(chǎn)物、堿基修飾鏈等“雜質(zhì)”；引物的終濃度一般為0.2~0.5μmol/L，過低會影響反應(yīng)產(chǎn)量，過高會增加引物二聚或錯配的幾率。
2. Taq DNA聚合酶具有5'→3'聚合酶活性和5'→3'外切酶活性，但無3'-5'外切酶活性，因此對單核苷酸的錯配無校正功能，發(fā)生堿基錯配的幾率為 2.1*10-4左右。然而Taq DNA聚合酶的優(yōu)勢在于反應(yīng)產(chǎn)量高于其他DNA聚合酶。Stratagene推出的Pfu DNA聚合酶一直是研究人員心目中最好的高保真酶，而Pfu DNA聚合酶經(jīng)基因工程改造后，新創(chuàng)出的Pfu Ultra具有更佳的校驗活力。數(shù)據(jù)顯示Pfu UltraTM高保真DNA聚合酶的平均錯配率為Pfu DNA聚合酶的1/3，為Taq DNA聚合酶的1/18，是目前保真度最高的PCR酶（保真度=1/錯誤率） （數(shù)據(jù)來源：美國冷泉港實驗室）。
3. Mg2+濃度也是影響反應(yīng)效率和特異性的重要因素之一。Taq DNA聚合酶對Mg2+濃度非常敏感，Mg2+可與模板DNA、引物及dNTP等的磷酸根結(jié)合，不同反應(yīng)體系中應(yīng)適當(dāng)調(diào)整MgCl2的濃度，一般以比 dNTP總濃度高出0.5~1.0mmol/L為宜，Mg2+過量能增加非特異擴增。
4. dNTP的濃度過高會增加堿基的錯誤摻入率，使反應(yīng)特異性下降；過低則會導(dǎo)致反應(yīng)速度下降。使用時4種dNTP必須以等當(dāng)量濃度配制，均衡的dNTP有利于減少錯配誤差和提高使用效率。
5. 溫度循環(huán)參數(shù)中應(yīng)特別注意復(fù)性溫度，它決定引物與模板的特異性結(jié)合。退火復(fù)性溫度可根據(jù)引物的長度，通過Tm=4(G+C)+2(A+T) 計算得到。在Tm允許的范圍內(nèi)，選擇較高的退火溫度可大大減少引物與模板之間的非特異結(jié)合。
6. 減低污染的常規(guī)措施：①將PCR試劑、PCR產(chǎn)物及其他分子生物學(xué)試劑分開放置；②應(yīng)保持樣品制備、PCR反應(yīng)液配制與PCR產(chǎn)物分析三個工作區(qū)的獨立性；③使用陽性和陰性對照；④使用最高質(zhì)量的水配制PCR實驗的所有反應(yīng)試劑；⑤配制好的PCR反應(yīng)試劑應(yīng)分成小包裝儲存，每個包裝僅用于單次實驗；⑥制備樣品、配制試劑及反應(yīng)液時必須戴手套；⑦實驗前一定要認(rèn)真清潔加樣器等。
7.RT
在做Northern等雜交實驗、構(gòu)建cDNA文庫、獲取能夠編碼真核生物蛋白的基因、獲得RNA病毒基因時，會用到RNA提取和RT-PCR技術(shù)。
真核生物的基因組是DNA，為什么不直接從DNA PCR得到我們需要的基因呢？因為真核生物的基因含有大量的非編碼區(qū)，稱為內(nèi)元（intron），真正編碼蛋白的區(qū)段是被這些內(nèi)元隔開的，這些編碼區(qū)叫做外元（exon）。真核生物的DNA轉(zhuǎn)錄成為RNA之后，經(jīng)過剪切和拼接，去掉這些非編碼區(qū)，才形成成熟的mRNA，由mRNA再翻譯成蛋白質(zhì)。
所以，如果直接從真核生物的基因組DNA獲取目的基因，克隆再表達，試圖獲取目的蛋白的思路是行不通的，因為獲取的DNA里面會含有非編碼區(qū)。要表達真核生物的基因并表達出相應(yīng)的蛋白，只能通過提取其mRNA并RT-PCR這條頗費周折的途徑。
1.RNA的提取 RNA的提取其實原理很簡單：通過變性劑破碎細(xì)胞或者組織，然后經(jīng)過氯仿等有機溶劑抽提RNA，再經(jīng)過沉淀，洗滌，晾干，最后溶解。但是由于RNA酶無處不在，隨時可能將RNA降解，所以實驗中有很多地方需要注意，稍有疏忽就會前功盡棄。
1.1 分離高質(zhì)量RNA 成功的cDNA合成來自高質(zhì)量的RNA。高質(zhì)量的RNA至少應(yīng)保證全長并且不含逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制劑，如EDTA或SDS。
RNA的質(zhì)量決定了你能夠轉(zhuǎn)錄到cDNA上的序列信息量的最大值。一般的RNA純化方法是使用異硫氰酸胍/酸性酚的一步法。
一般不必使用oligo(dT)選擇性分離poly(A)+RNA。不管起始模板是總RNA還是poly(A)+ RNA，都可以檢測到擴增結(jié)果。
另外，分離poly(A)+RNA會導(dǎo)致樣品間mRNA豐度的波動變化，從而使信息的檢出和定量產(chǎn)生偏差。然而，當(dāng)分析稀有mRNA時，poly(A)+RNA會增加檢測的靈敏度。
1.2 RNA提取的最大影響因素-RNA酶 在所有RNA實驗中，最關(guān)鍵的因素是分離得到全長的RNA。而實驗失敗的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。
由于RNA酶廣泛存在而穩(wěn)定，可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等，RNA酶催化的反應(yīng)一般不需要輔助因子。因而RNA制劑中只要存在少量的RNA酶就會引起RNA在制備與分析過程中的降解，而所制備的RNA的純度和完整性又可直接影響RNA分析的結(jié)果，所以RNA的制備與分析操作難度極大。
在實驗中，一方面要嚴(yán)格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制內(nèi)源性的RNA酶。外源性的RNA酶存在于操作人員的手汗、唾液等，也可存在于灰塵中。
在其它分子生物學(xué)實驗中使用的RNA酶也會造成污染。這些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、電泳槽、研究人員的手及各種試劑。
而各種組織和細(xì)胞中則含有大量內(nèi)源性的RNA酶。 1.3 常用的RNA酶抑制劑 *焦碳酸二乙酯（DEPC）：是一種強烈但不徹底的RNA酶抑制劑。
它通過和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，從而抑制酶的活性。 *異硫氰酸胍：目前被認(rèn)為是最有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時也使RNA酶失活。
它既可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白中解離出來，又對RNA酶有強烈的變性作用。 *氧釩核糖核苷復(fù)合物：由氧化釩離子和核苷形成的復(fù)合物，它和RNA酶結(jié)合形成過渡態(tài)類物質(zhì)，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。
*RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結(jié)合，使其失活。
*其它：SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用。 1.4 防止RNA酶污染的措施、RNA提取之前需要注意和準(zhǔn)備的工作 *盡可能在實驗室專門辟出RNA操作區(qū)，離心機、移液器、試劑等均應(yīng)專用。
RNA操作區(qū)應(yīng)保持清潔，并定期進行除菌。 *操作過程中應(yīng)始終戴一次性橡膠手套和口罩，并經(jīng)常更換，以防止手、臂上的細(xì)菌和真菌以及人體自身分泌的RNase帶入各種容器內(nèi)或污染用具。
盡量避免使用一次性塑料手套。塑料手套不僅常常給操作帶來不便，而且塑料手套的多出部分常常將器具有RNase處傳遞到RNase-free處，擴大污染。
*盡量使用一次性的塑料制品，避免共用器具如濾紙、tips、tubes等，以防交叉污染。例如，從事RNA探針工作的研究者經(jīng)常使用RNase H、T1等，在操作過程中極有可能造成移液器、離心機等的污染。
而這些污染了的器具是RNA操作的大敵。 *關(guān)于一次性塑料制品，建議使用廠家供應(yīng)的出廠前已經(jīng)滅菌的tips和tubes等。
多數(shù)廠家供應(yīng)的無菌塑料制品很少有RNase污染，買來后可直接用于RNA操作。用DEPC等處理的塑料制品，往往由于二次污染而帶有RNase，從而導(dǎo)致實驗失敗。
*所有的玻璃器皿均應(yīng)在使用前于180℃的高溫下干烤6hr或更長時間。 *無法用DEPC處理的用具可用氯仿擦拭若干次，這樣通?？梢韵齊Nase的活性。
*配制溶液用的乙醇、異丙醇、Tris等應(yīng)采用未開封的新瓶裝試劑。 *塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。
*有機玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室溫10min，然后用0.1% DEPC水沖洗，晾干。 *配制的溶液應(yīng)盡可能的用0.1% DEPC，在37℃處理。
8.PCR實驗操作注意事項有哪些
1、必須在無菌無塵環(huán)境下進行操作；
2、檢測人員必須通過國家臨檢中心業(yè)務(wù)培訓(xùn)并取得合格證書；
3、必須擁有標(biāo)準(zhǔn)的的PCR熒光實驗室；
4、后PCR區(qū)PCR完成以后，應(yīng)該留出一個專門用于反應(yīng)后處理樣品的地方。
擴展資料
PCR實驗特點：
1、靈敏度高：PCR實驗產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能從100萬個細(xì)胞中檢出一個靶細(xì)胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達3個RFU；在細(xì)菌學(xué)中最小檢出率為3個細(xì)菌。
2、簡便、快速：PCR實驗反應(yīng)一般在2~4 小時完成擴增反應(yīng)。擴增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。
3、純度要求低：不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA 粗制品及RNA均可作為擴增模板?？芍苯佑门R床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等DNA擴增檢測。
參考資料來源：百度百科-PCR實驗室
