菌計數方法(微生物計數方法)

1.微生物計數方法有哪些

測定微生物計數的方法有很多，主要有以下幾種：

1.血細胞計數法

將稀釋的菌液樣品滴在血細胞計數板上，在顯微鏡下計算4~5個(gè)中格的細菌數，并求出每個(gè)小格所含細菌的平均數，再以此為依據，估算總菌數.

①此法的缺點(diǎn)是不能區分死菌和活菌.

②對壓在小方格界線(xiàn)上的細菌，應當取平均值計數.

③此法可用于測定培養液中酵母菌種群數量的變化

2.稀釋涂布平板法

原理：每個(gè)活細菌在適宜的培養基和良好的生長(cháng)條件下可以通過(guò)生長(cháng)形成菌落.培養基表面生長(cháng)的一個(gè)菌落，來(lái)源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌.

①這一方法常用來(lái)統計樣品中活菌的數目

②統計的菌落數往往比活菌的實(shí)際數目低，原因是當兩個(gè)活多個(gè)細胞連在一起時(shí)，平板上觀(guān)察到的只是一個(gè)菌落.因此統計結果一般用菌落數而不是用活菌數來(lái)表示.

③土壤、水、牛奶、食品和其他材料中所含細菌、酵母、芽孢與孢子等的數量均可用此法測定.但不適于測定樣品中絲狀體微生物，例如放線(xiàn)菌或絲狀真菌或絲狀藍細菌等的營(yíng)養體等.

④此法若不培養成菌落，可通過(guò)將一定量的菌液均勻地涂布在玻片上的一定面積上，經(jīng)固定染色后在顯微鏡下計數，這樣又稱(chēng)涂片計數法.染色可用臺盼藍，臺盼藍能使死細胞染成藍色，可分別計數死細胞和活細胞.

3.濾膜法

濾膜法是當樣品中菌數很低時(shí)，可將一定體積的湖水、海水或飲用水燈樣品通過(guò)膜過(guò)濾器.然后將濾膜干燥、染色，并經(jīng)處理使膜透明，再在顯微鏡下計算膜上（或一定面積上）的細菌數.

此法也可以通過(guò)培養觀(guān)察形成的菌落數來(lái)推算樣品中的菌數.例如測定飲用水中大腸桿菌的數目：將已知體積的水過(guò)濾后，將濾膜放在伊紅美藍培養基上培養.在該培養基上大腸桿菌的菌落呈現黑色，可根據培養基上黑色菌落的數目，計算出水樣中大腸桿菌的數目.

此法也是統計樣品中活菌的數目.

4.比濁法

原理是在一定范圍內，菌是懸液中細胞濃度與混濁度成正比，即與光密度成正比，菌越多，光密度越大.因此可借助與分光光度計，在一定波長(cháng)下，測定菌懸液的光密度，以光密度表示菌量.實(shí)驗測量時(shí)一定要控制在菌濃度與光密度成正比的線(xiàn)性范圍內，否則不準確.

5.顯微鏡直接計數法

在課本生物選修1生物技術(shù)實(shí)踐P22中“除了上述活菌計數法外，顯微鏡直接計數也是測定微生物數量的常用方法.”這里說(shuō)的顯微鏡直接計數，我認為應該是在稀釋涂布的基礎上不培養成菌落而通過(guò)染色的方法在顯微鏡下直接計數.再如濾膜法也一樣，可以有兩種情況.

另外，微生物計數法發(fā)展迅速，多種多樣的快速、簡(jiǎn)易、自動(dòng)化的儀器和裝置等方法可以用來(lái)統計微生物的數目.

2.統計活菌數量的方法都有哪些

統計菌落數目的方法有直接計數法和間接計數法兩種。

1. 直接計數法

直接計數法是將稀釋的樣品滴在計數板上，蓋上蓋玻片，然后在顯微鏡下計數4?5個(gè)中格的細菌數，并求出每個(gè)小格所含細菌的平均數，再按公式求出每 毫升樣品中所含的細菌數。計算公式 為：每毫升原液所含細菌數=每小格平 均細菌數X400X1 000X稀釋倍數。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是所需設備比較簡(jiǎn)單，能迅速得到結果，而且在計數的同時(shí)還可以觀(guān)察到所研究的微生物的形態(tài)特征； 缺點(diǎn)是不能區分死菌與活菌。

2. 間接計數法

在應用稀釋涂布平板法計數時(shí)，首先要將待測樣品配制成均勻的系列稀釋液，盡量使微生物細胞分散開(kāi)，再把稀釋液接種到平板上，進(jìn)行培養觀(guān)察。但值得注意的是，統計的菌落數往往比活菌 的實(shí)際數目低，而且統計的結果一般用 菌落數而不用活菌數來(lái)表示。計算公式為：每克樣品中的菌落數= （C+V）X M，其中，C表示某一稀釋度下平板上生長(cháng)的平均菌落數，V表示涂布平板時(shí)所 用的稀釋液的體積（mL）,M代表稀釋倍數。

3.菌落計數有哪些的方法

原發(fā)布者：jxc2520

食品微生物學(xué)檢驗菌落總數測定一、培養基和試劑1、平板計數瓊脂（platecountagar,PCA）培養基成分胰蛋白胨5.0g酵母浸膏2.5g葡萄糖1.0g瓊脂15.0g蒸餾水1000mLpH7.0±0.2制法：將上述成分加于蒸餾水中，煮沸溶解，調節pH。分裝試管或錐形瓶，121℃高壓滅菌15min。2、磷酸鹽緩沖液成分磷酸二氫鉀（KH2PO4）34.0g蒸餾水500mLpH7.2制法：貯存液：稱(chēng)取34.0g的磷酸二氫鉀溶于500mL蒸餾水中，用大約175mL的1mol/L氫氧化鈉溶液調節pH，用蒸餾水稀釋至1000mL后貯存于冰箱。稀釋液：取貯存液1.25mL，用蒸餾水稀釋至1000mL，分裝于適宜容器中，121℃高壓滅菌15min。3、無(wú)菌生理鹽水成分氯化鈉8.5g蒸餾水1000mL制法：稱(chēng)取8.5g氯化鈉溶于1000mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌15min。二、操作步驟樣品的稀釋1、固體和半固體樣品：稱(chēng)取25g樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)杯內，8000r/min~10000r/min均質(zhì)1min~2min，或放入盛有225mL稀釋液的無(wú)菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min~2min，制成1:10的樣品勻液。2、液體樣品：以無(wú)菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌錐形瓶（瓶?jì)阮A置適當數量

4.試述微生物活菌計數方法有哪幾種

v常用測定微生物生長(cháng)的方法有：1）稱(chēng)干重法。

可用離心法或過(guò)濾法測定。優(yōu)點(diǎn)：可適用于一切微生物，缺點(diǎn)：無(wú)法區別死菌和活菌。

2）比濁法。原理：由于微生物在液體培養時(shí)，原生質(zhì)的增加導致混濁度的增加，可用分光光度計測定。

優(yōu)點(diǎn)：比較準確。3）測含氮量，大多數微生物的含氮量占干重的比例較一致，根據含氮量再乘以6.25即可測得其粗蛋白的含量。

4）血球計數板法。優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、快速、直觀(guān)。

缺點(diǎn)：結果包括死菌和活菌。5）液體稀釋法。

對未知菌樣作連續的10倍系列稀釋?zhuān)?jīng)培養后，記錄每個(gè)稀釋度出現生長(cháng)的試管數，然后查MPN表，再根據樣品的稀釋倍數就可計算其中的活菌含量。優(yōu)點(diǎn)：可計算活菌數，較準確。

缺點(diǎn)：比較繁瑣。6）平板菌落計數法。

取一定體積的稀釋菌液涂布在合適的固體培養基，經(jīng)培養后計算原菌液的含菌數。優(yōu)點(diǎn)，可以獲得活菌的信息。

缺點(diǎn)：操作繁瑣，需要培養一定時(shí)間才能獲得，測定結果受多種因素的影響。

5.微生物計數方法有哪些

微生物的顯微直接計數法

一、實(shí)驗目的

了解血球計數板的構造、計數原理和計數方法，掌握顯微鏡下直接計數的技能。

二、實(shí)驗原理

測定微生物細胞數量的方法很多，通常采用的有顯微直接計數法和平板計數法。

顯微計數法適用于各種含單細胞菌體的純培養懸浮液，如有雜菌或雜質(zhì)，常不易分辨。菌體較大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球計數板，一般細菌則采用彼得羅夫·霍澤（Petrof Hausser）細菌計數板。兩種計數板的原理和部件相同，只是細菌計數板較薄，可以使用油鏡觀(guān)察。而血球計數板較厚，不能使用油鏡，計數板下部的細菌不易看清。

血球計數板是一塊特制的厚型載玻片，載玻片上有4條槽而構成3個(gè)平臺。中間的平臺較寬，其中間又被一短橫槽分隔成兩半，每個(gè)半邊上面各有一個(gè)計數區（圖21-1），計數區的刻度有兩種：一種是計數區分為16個(gè)大方格（大方格用三線(xiàn)隔開(kāi)），而每個(gè)大方格又分成25個(gè)小方格；另一種是一個(gè)計數區分成25個(gè)大方格（大方格之間用雙線(xiàn)分開(kāi)），而每個(gè)大方格又分成16個(gè)小方格。但是不管計數區是哪一種構造，它們都有一個(gè)共同特點(diǎn)，即計數區都由400個(gè)小方格組成。

計數區邊長(cháng)為1mm，則計數區的面積為l mm2，每個(gè)小方格的面積為1/400mm2。蓋上蓋玻片后，計數區的高度為0.1mm，所以每個(gè)計數區的體積為0.1mm3，每個(gè)小方格的體積為1/4000mm3。

使用血球計數板計數時(shí)，先要測定每個(gè)小方格中微生物的數量，再換算成每毫升菌液（或每克樣品）中微生物細胞的數量。

已知：1mm3體積=10 mm*10 mm*10 mm= 1000mm3

所以：1mm3體積應含有小方格數為1000mm3/1/4000mm3=4*106個(gè)小方格，即系數K=4*106 。

因此：每ml菌懸液中含有細胞數= 每個(gè)小格中細胞平均數（N）*系數（K）*菌液稀釋倍數（d）

三、實(shí)驗器材

1.活材料：釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）斜面或培養液。

2.器材：顯微鏡、血球計數板、蓋玻片（22mm*22mm）、吸水紙、計數器、滴管、擦鏡紙。

四、實(shí)驗方法

1.視待測菌懸液濃度，加無(wú)菌水適當稀釋?zhuān)ㄐ泵嬉话阆♂尩?0-2），以每小格的菌數可數為度。

2.取潔凈的血球計數板一塊，在計數區上蓋上一塊蓋玻片。

3.將酵母菌懸液搖勻，用滴管吸取少許，從計數板中間平臺兩側的溝槽內沿蓋玻片的下邊緣摘入一小滴（不宜過(guò)多），讓菌懸液利用液體的表面張力充滿(mǎn)計數區，勿使氣泡產(chǎn)生，并用吸水紙吸去溝槽中流出的多余菌懸液。也可以將菌懸液直接滴加在計數區上，不要使計數區兩邊平臺沾上菌懸液，以免加蓋蓋玻片后，造成計數區深度的升高。然后加蓋蓋玻片（勿使產(chǎn)生氣泡）。4.靜置片刻，將血球計數板置載物臺上夾穩，先在低倍鏡下找到計數區后，再轉換高倍鏡觀(guān)察并計數。由于生活細胞的折光率和水的折光率相近，觀(guān)察時(shí)應減弱光照的強度。

5.計數時(shí)若計數區是由16個(gè)大方格組成，按對角線(xiàn)方位，數左上、左下、右上、右下的4個(gè)大方格（即100小格）的菌數。如果是25個(gè)大方格組成的計數區，除數上述四個(gè)大方格外，還需數中央l個(gè)大方格的菌數（即80個(gè)小格）。如菌體位于大方格的雙線(xiàn)上，計數時(shí)則數上線(xiàn)不數下線(xiàn)，數左線(xiàn)不數右線(xiàn)，以減少誤差。

6.對于出芽的酵母菌，芽體達到母細胞大小一半時(shí)，即可作為兩個(gè)菌體計算。每個(gè)樣品重復計數2—3次（每次數值不應相差過(guò)大，否則應重新操作），求出每一個(gè)小格中細胞平均數（N），按公式計算出每ml(g)菌懸液所含酵母菌細胞數量。

7.測數完畢，取下蓋玻片，用水將血球計數板沖洗干凈，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免損壞網(wǎng)格刻度。洗凈后自行晾干或用吹風(fēng)機吹干，放入盒內保存。

五、實(shí)驗作業(yè)：

將實(shí)驗結果填入下表中：

計數次數 每個(gè)大方格菌數 稀 釋

倍 數 試管斜面中的總菌數 平均值

1 2 3 4 5

第一次

第二次

6.微生物計數方法有哪些

測定微生物計數的方法有很多，主要有以下幾種：1.血細胞計數法將稀釋的菌液樣品滴在血細胞計數板上，在顯微鏡下計算4~5個(gè)中格的細菌數，并求出每個(gè)小格所含細菌的平均數，再以此為依據，估算總菌數.①此法的缺點(diǎn)是不能區分死菌和活菌.②對壓在小方格界線(xiàn)上的細菌，應當取平均值計數.③此法可用于測定培養液中酵母菌種群數量的變化2.稀釋涂布平板法原理：每個(gè)活細菌在適宜的培養基和良好的生長(cháng)條件下可以通過(guò)生長(cháng)形成菌落.培養基表面生長(cháng)的一個(gè)菌落，來(lái)源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌.①這一方法常用來(lái)統計樣品中活菌的數目②統計的菌落數往往比活菌的實(shí)際數目低，原因是當兩個(gè)活多個(gè)細胞連在一起時(shí)，平板上觀(guān)察到的只是一個(gè)菌落.因此統計結果一般用菌落數而不是用活菌數來(lái)表示.③土壤、水、牛奶、食品和其他材料中所含細菌、酵母、芽孢與孢子等的數量均可用此法測定.但不適于測定樣品中絲狀體微生物，例如放線(xiàn)菌或絲狀真菌或絲狀藍細菌等的營(yíng)養體等.④此法若不培養成菌落，可通過(guò)將一定量的菌液均勻地涂布在玻片上的一定面積上，經(jīng)固定染色后在顯微鏡下計數，這樣又稱(chēng)涂片計數法.染色可用臺盼藍，臺盼藍能使死細胞染成藍色，可分別計數死細胞和活細胞.3.濾膜法濾膜法是當樣品中菌數很低時(shí)，可將一定體積的湖水、海水或飲用水燈樣品通過(guò)膜過(guò)濾器.然后將濾膜干燥、染色，并經(jīng)處理使膜透明，再在顯微鏡下計算膜上（或一定面積上）的細菌數.此法也可以通過(guò)培養觀(guān)察形成的菌落數來(lái)推算樣品中的菌數.例如測定飲用水中大腸桿菌的數目：將已知體積的水過(guò)濾后，將濾膜放在伊紅美藍培養基上培養.在該培養基上大腸桿菌的菌落呈現黑色，可根據培養基上黑色菌落的數目，計算出水樣中大腸桿菌的數目.此法也是統計樣品中活菌的數目.4.比濁法原理是在一定范圍內，菌是懸液中細胞濃度與混濁度成正比，即與光密度成正比，菌越多，光密度越大.因此可借助與分光光度計，在一定波長(cháng)下，測定菌懸液的光密度，以光密度表示菌量.實(shí)驗測量時(shí)一定要控制在菌濃度與光密度成正比的線(xiàn)性范圍內，否則不準確.5.顯微鏡直接計數法在課本生物選修1生物技術(shù)實(shí)踐P22中“除了上述活菌計數法外，顯微鏡直接計數也是測定微生物數量的常用方法.”這里說(shuō)的顯微鏡直接計數，我認為應該是在稀釋涂布的基礎上不培養成菌落而通過(guò)染色的方法在顯微鏡下直接計數.再如濾膜法也一樣，可以有兩種情況.另外，微生物計數法發(fā)展迅速，多種多樣的快速、簡(jiǎn)易、自動(dòng)化的儀器和裝置等方法可以用來(lái)統計微生物的數目。

7.1.測定微生物數量的方法有哪些

細菌計數1.計數器測定法：

即用血細胞計數器進(jìn)行計數。取一定體積的樣品細胞懸液置于血細胞計數器的計數室內，用顯微鏡觀(guān)察計數。由于計數室的容積是一定的（O.1mm3），因而根據計數器刻度內的細菌數，可計算樣品中的含菌數。本法簡(jiǎn)便易行，可立即得出結果。

本法不僅適于細菌計數，也適用于酵母菌及霉菌孢子計數。

2、電子計數器計數法：

電子計數器的工作原理是測定小孔中液體的電阻變化，小孔僅能通過(guò)一個(gè)細胞，當一個(gè)細胞通過(guò)這個(gè)小孔時(shí)，電阻明顯增加，形成一個(gè)脈沖，自動(dòng)記錄在電子記錄裝置上。

該法測定結果較準確，但它只識別顆粒大小，而不能區分是否為細菌。因此，要求菌懸液中不含任何碎片。

3、活細胞計數法

常用的有平板菌落計數法，是根據每個(gè)活的細菌能長(cháng)出一個(gè)菌落的原理設計的。取一定容量的菌懸液，作一系列的倍比稀釋?zhuān)缓髮⒍康南♂屢哼M(jìn)行平板培養，根據培養出的菌落數，可算出培養物中的活菌數。此法靈敏度高，是一種檢測污染活菌數的方法，也是目前國際上許多國家所采用的方法。使用該法應注意：①一般選取菌落數在30~300之間的平板進(jìn)行計數，過(guò)多或過(guò)少均不準確；②為了防止菌落蔓延，影響計數，可在培養基中加入O.001%2,3,5一氯化三苯基四氮唑（TTC）；③本法限用于形成菌落的微生物。

廣泛應用于水、牛奶、食物、藥品等各種材料的細菌檢驗，是最常用的活菌計數法。

4、比濁法

比濁法是根據菌懸液的透光量間接地測定細菌的數量。細菌懸浮液的濃度在一定范圍內與透光度成反比，與光密度成正比，所以，可用光電比色計測定菌液，用光密度（OD值）表示樣品菌液濃度。

此法簡(jiǎn)便快捷，但只能檢測含有大量細菌的懸浮液，得出相對的細菌數目，對顏色太深的樣品，不能用此法測定。

5、測定細胞重量法

此法分為濕重法和干重法。濕重法系單位體積培養物經(jīng)離心后將濕菌體進(jìn)行稱(chēng)重；干重法系單位體積培養物經(jīng)離心后，以清水洗凈放人干燥器加熱烘干，使之失去水分然后稱(chēng)重。

此法適于菌體濃度較高的樣品，是測定絲狀真菌生長(cháng)量的一種常用方法。

6、測定細胞總氮量或總碳量

氮、碳是細胞的主要成分，含量較穩定，測定氮、碳的含量可以推知細胞的質(zhì)量。此法適于細胞濃度較高的樣品。

7、顏色改變單位法（colour change unit，簡(jiǎn)稱(chēng)CCU）

這種方法通常用于很小，用一般的比濁法無(wú)法計數的微生物，比如支原體等，因為支原體的液體培養物是完全透明的，呈現為清亮透明紅色，因此無(wú)法用比濁法來(lái)計數，由于支原體固體培養很困難，用cfu法也不容易計數，因此需要用特殊的計數方法，即CCU法。它是以微生物在培養基中的代謝活力為指標，來(lái)計數微生物的相對含量的，下面以解脲脲原體為例單介紹其操作：，簡(jiǎn)

(1)取12只無(wú)菌試管，每一管裝1.8ml解脲脲原體培養基。

(2)在第一管加入0.2ml待測解脲脲原體菌液，充分混勻，從中吸取0.2ml加入第二管，依次類(lèi)推，10倍梯度稀釋?zhuān)恢钡阶钅┮还?/p>

(3)于37度培養，以培養基顏色改變的最末一管作為待測菌液的CCU，也就是支原體的最大代謝活力，比如第六管出現顏色改變，他的相對濃度就是10的6次方CCU/ml.

一般來(lái)說(shuō)，比濁法和菌落計數法就可以滿(mǎn)足絕大多數細菌的計數，但是對支原體這樣比較特殊的微生物，用CCU法比較合適。

8.統計菌落數目的方法有哪些

統計菌落數目的方法有直接計數法 和間接計數法兩種。

1. 直接計數法直接計數法是將稀釋的樣品滴在計 數板上，蓋上蓋玻片，然后在顯微鏡下計 數4?5個(gè)中格的細菌數，并求出每個(gè)小 格所含細菌的平均數，再按公式求出每 毫升樣品中所含的細菌數。計算公式 為：每毫升原液所含細菌數=每小格平 均細菌數X400X1 000X稀釋倍數。

這 種方法的優(yōu)點(diǎn)是所需設備比較簡(jiǎn)單，能 迅速得到結果，而且在計數的同時(shí)還可 以觀(guān)察到所研究的微生物的形態(tài)特征； 缺點(diǎn)是不能區分死菌與活菌。2. 間接計數法在應用稀釋涂布平板法計數時(shí)，首 先要將待測樣品配制成均勻的系列稀釋 液，盡量使微生物細胞分散開(kāi)，再把稀釋 液接種到平板上，進(jìn)行培養觀(guān)察。

但值 得注意的是，統計的菌落數往往比活菌 的實(shí)際數目低，而且統計的結果一般用 菌落數而不用活菌數來(lái)表示。計算公式 為：每克樣品中的菌落數= （C+V）X M，其中，C表示某一稀釋度下平板上生長(cháng)的平均菌落數，V表示涂布平板時(shí)所 用的稀釋液的體積（mL）,M代表稀釋 倍數。