真菌性污染的檢測方法(微生物室常用的病原真菌檢查方法)

1.微生物室常用的病原真菌檢查方法有哪些

您好！

1、真菌鏡檢

是最簡單也是很有價值的實驗室診斷方法。其優(yōu)點在于簡便、快速，無菌部位的陽性結果可直接確定真菌感染。但是由于陽性率較低，陰性結果亦不能排除診斷。直 接鏡檢對于淺表和皮下真菌感染最有幫助。在皮膚刮屑、毛發(fā)或甲標本中發(fā)現(xiàn)皮膚癬菌、念珠菌和馬拉色菌的成分可提供對相應真菌病的可靠診斷。如在無菌體液的 直接鏡檢中發(fā)現(xiàn)真菌成分常可確立深部真菌病的診斷，例如在腦脊液中檢測到帶莢膜的新生隱球菌酵母細胞，或外周血涂片中檢測到莢膜組織胞漿菌細胞。但一般在 有菌部位則只有發(fā)現(xiàn)大量真菌菌絲方才有意義，通過直接鏡檢一般可以區(qū)分念珠菌、隱球菌、暗色真菌、毛霉（接合菌）等菌的感染，進一步明確鑒定菌種需要通過 培養(yǎng)鑒定來完成。

2、真菌培養(yǎng)

真菌培養(yǎng)是實驗室檢查中的重要環(huán)節(jié)，培養(yǎng)出致病真菌是進一步鑒定菌種的前提條件。真菌培養(yǎng)第一步是從臨床標本中培養(yǎng)真菌的初代培養(yǎng)，初代培養(yǎng)后進一步進行 分離純化培養(yǎng)和鑒定培養(yǎng)。不同致病真菌每一步所采用的培養(yǎng)基，培養(yǎng)時間和培養(yǎng)溫度存在一定的差異。常規(guī)的真菌培養(yǎng)需要在28-30°C溫度下培養(yǎng)3-4 周，一般初代培養(yǎng)選用沙氏培養(yǎng)基（SDA）或者馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（PDA），采用試管培養(yǎng)，一般同時培養(yǎng)兩管，其中一管可添加抗生素（氯霉素或慶大霉素均 可）。在培養(yǎng)1周內，應該每天觀察有無真菌生長。一般培養(yǎng)4周后，如果無真菌生長可報陰性。發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)出真菌，直接挑取少量菌體或者小培養(yǎng)后，用乳酸酚棉蘭 制成涂片顯微鏡下觀察，結合菌落大體形態(tài)，典型菌種可直接報告種屬。不典型菌種根據基本表現(xiàn)，采用適當?shù)臉藴疏b定培養(yǎng)基，標準培養(yǎng)條件培養(yǎng)，必要時要結合 生理學和分子生物學方法進行鑒定。

3、真菌鑒定

對常見致病真菌要掌握的鑒定原則是首先區(qū)分酵母菌和霉菌。

如果初代培養(yǎng)基上培養(yǎng)出酵母樣菌落，在鑒定前應進行分離純化。在去除細菌和其他真菌污染，區(qū)分混合感染后，對純菌落進行鑒定。酵母菌鑒定主要根據形態(tài)學特 征和生理生化特點，按照一定的流程進行。首先根據菌落顏色進行分類。臨床最為常見的是白色或奶白色菌落，這類菌進一步做芽管試驗，若芽管試驗是陽性則為白 念珠菌，若陰性則通過Vitek YBC或API20C及玉米吐溫瓊脂上培養(yǎng)的形態(tài)特征來鑒定。另外，還可以應用念珠菌顯色瓊脂、尿素酶試驗等試驗來輔助鑒定。

檢驗地帶網

霉菌的鑒定非常復雜，有許多標準包括形態(tài)學特征、溫度耐受性，放線菌酮抗性、雙相性、營養(yǎng)需求、蛋白分解活動以及水解尿素能力等。現(xiàn)代分類學鑒定方法主要 依據分生孢子的個體發(fā)生過程結合其他特征來進行鑒定。初代培養(yǎng)后根據形態(tài)學特征一般可鑒定到屬的水平，再依據不同真菌的鑒定要求，采用標準培養(yǎng)基和培養(yǎng)條 件進一步完成菌種鑒定。例如：曲霉屬鑒定時需要采用標準培養(yǎng)基，即察氏培養(yǎng)基和麥芽瓊脂，25℃培養(yǎng)7天后與曲霉形態(tài)鑒定檢索表對應得到正確的結果。

2.怎樣檢測環(huán)境中的細菌和真菌

1、選取五套培養(yǎng)皿進行實驗，一個做為對比，另外四個用來培養(yǎng)不同環(huán)境中的細菌，并且是在不同的環(huán)境中培養(yǎng)，以便得出細菌和真菌的生存條件。

2、培養(yǎng)皿經過高溫滅菌，準備至少5套培養(yǎng)皿。因為對比不同環(huán)境中的細菌與真菌的存在情況，是屬于單因素比較，所以除了采樣地點是變量外，進行微生物培養(yǎng)的條件等也要保持一致

3、經過高溫處理后可以將培養(yǎng)皿上、培養(yǎng)基內混有的細菌或真菌的孢子等殺死（經過嚴格的高溫滅菌的環(huán)境中是不可能有細菌和真菌存在的），這樣就排除了實驗外其他環(huán)境的污染。因此，在實驗前不要盲目的打開培養(yǎng)皿，以防止細菌或真菌的孢子等落在培養(yǎng)基上，實驗中用無菌棉棒的目的同樣是為了防止棉棒上的微生物污染培養(yǎng)基。

4、在不同的環(huán)境中細菌的分布是不相同的，因此在采集菌種的時候要注意選擇環(huán)境，做到要有一定的代表性。

5、接種好的培養(yǎng)基要放在特定的環(huán)境條件下進行培養(yǎng)。

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3.曲霉菌感染檢測方法有哪些

GM抗原的檢測目前最主流的方法是經典的一步法酶聯(lián)免疫試驗，目前國內外廣泛認可的檢測產品是由美國Bio-Rad公司提供的曲霉菌抗原檢測試劑盒（），可快速、靈敏的發(fā)現(xiàn)血液循環(huán)中的GM抗原，幫助臨床實現(xiàn)早期發(fā)現(xiàn)曲霉菌感染。

GM抗原是曲霉菌半乳甘露聚糖（galactomannan,GM）抗原的簡稱，是曲霉菌胞壁的組成成分，在菌絲生長過程中可釋放人血液，檢測患者血清中GM抗原水平有助于侵襲性曲霉菌?。↖nvasive Aspergillosis, IA）的早期診斷。推薦首次檢測時間點一般為當臨床懷疑患者發(fā)生IA時，或者需要對免疫妥協(xié)患者進行常規(guī)篩查時。1另外，對于開始進行抗真菌治療的患者，推薦進行每周兩次的GM水平監(jiān)測，以幫助判斷臨床療效及患者預后。2

由于血清學試驗為間接檢測手段，除外檢測試劑盒的選擇，感染曲霉菌類型、宿主本身、以及使用的診斷標準和方法等，都可能影響檢測結果。所以在檢測過程中，需要注意各種影響的因素，以盡可能獲得準確的結果，避免出現(xiàn)假陽性或假陰性而干擾了最終的臨床診斷，延誤患者診治。在不考慮檢測者本身操作原因及試驗環(huán)境污染等因素的前提下，我們來了解下哪些因素可能會影響試驗結果：3

生物學因素：

· 感染部位（比如鼻竇，肺部，還是播散性）

· 感染部位的微環(huán)境（比如營養(yǎng)，氧含量，PH值）

· 曲霉菌種類

· 是否使用抗真菌藥物

· 釋放的GM抗原分子結構

· 患者免疫抑制的程度

· 腎臟清除率，肝代謝情況

· 患者體內是否存在GM抗體

· 樣本的保存條件及時間

· 患者檢測前的治療情況

流行病學因素：

· 患者所屬人群

· 當?shù)馗腥玖餍新?/p>

· 樣本采集手段

· Cut-off值的設定

· 感染患者的界定標準

· 實驗室檢測經驗

由于對結果的影響因素眾多，為了確保最終結果的準確性，選擇高質量的檢測試劑盒就顯得至關重要，即便選擇了值得信賴的檢測產品，操作者在分析GM抗原檢測結果時，還是需要結合各種客觀的影響因素，為臨床提供最為準確可性的報告。

4.病原微生物中細菌常見檢測方法有哪些

細菌 [what]什么是細菌？細菌（英文：germs;bacteria）隸屬生物學一類，是在自然界分布最廣、個體數(shù)量最多的有機體，是大自然物質循環(huán)的主要參與者。

細菌主要由細胞壁、細胞膜、細胞質、核質體等部分構成，有的細菌還有夾膜、鞭毛、菌毛等特殊結構。絕大多數(shù)細菌的直徑大小在0.5~5μm之間。

可根據形狀分為三類，即：球菌、桿菌和螺旋菌（包括弧形菌）。 還有一種利用細菌的生活方式來分類，即可分為兩大類：腐生生活與寄生生活。

（一）細胞壁 細胞壁厚度因細菌不同而異，一般為15-30nm。主要成分是肽聚糖，由n-乙酰葡糖胺和n-乙酰胞壁酸構成雙糖單元，以β（1-4）糖苷鍵連接成大分子。

n-乙酰胞壁酸分子上有四肽側鏈，相鄰聚糖纖維之間的短肽通過肽橋（革蘭氏陽性菌）或肽鍵（革蘭氏陰性菌）橋接起來，形成了肽聚糖片層，像膠合板一樣，粘合成多層。 肽聚糖中的多糖鏈在各物種中都一樣，而橫向短肽鏈卻有種間差異。

革蘭氏陽性菌細胞壁厚約20~80nm，有15-50層肽聚糖片層，每層厚1nm，含20-40%的磷壁酸（teichoic acid），有的還具有少量蛋白質。革蘭氏陰性菌細胞壁厚約10nm，僅2-3層肽聚糖，其他成分較為復雜，由外向內依次為脂多糖、細菌外膜和脂蛋白。

此外，外膜與細胞之間還有間隙。 肽聚糖是革蘭陽性菌細胞壁的主要成分，凡能破壞肽聚糖結構或抑制其合成的物質，都有抑菌或殺菌作用。

如溶菌酶是n-乙酰胞壁酸酶，青霉素抑制轉肽酶的活性，抑制肽橋形成。 細菌細胞壁的功能包括：保持細胞外形；抑制機械和滲透損傷（革蘭氏陽性菌的細胞壁能耐受20kg/cm2的壓力）；介導細胞間相互作用（侵入宿主）；防止大分子入侵；協(xié)助細胞運動和分裂。

脫壁的細胞稱為細菌原生質體（bacterial protoplast）或球狀體（spheroplast，因脫壁不完全），脫壁后的細菌原生質體，生存和活動能力大大降低。 （二）細胞膜 是典型的單位膜結構，厚約8~10nm，外側緊貼細胞壁，某些革蘭氏陰性菌還具有細胞外膜。

通常不形成內膜系統(tǒng)，除核糖體外，沒有其它類似真核細胞的細胞器，呼吸和光合作用的電子傳遞鏈位于細胞膜上。某些行光合作用的原核生物（藍細菌和紫細菌），質膜內褶形成結合有色素的內膜，與捕光反應有關。

某些革蘭氏陽性細菌質膜內褶形成小管狀結構，稱為中膜體（mesosome）或間體（圖3-11），中膜體擴大了細胞膜的表面積，提高了代謝效率，有擬線粒體（chondroid）之稱，此外還可能與dna的復制有關。 （三）細胞質與核質體 細菌和其它原核生物一樣，沒有核膜，dna集中在細胞質中的低電子密度區(qū)，稱核區(qū)或核質體（nuclear body）。

細菌一般具有1-4個核質體，多的可達20余個。核質體是環(huán)狀的雙鏈dna分子，所含的遺傳信息量可編碼2000~3000種蛋白質，空間構建十分精簡，沒有內含子。

由于沒有核膜，因此dna的復制、rna的轉錄與蛋白的質合成可同時進行，而不像真核細胞那樣這些生化反應在時間和空間上是嚴格分隔開來的。 每個細菌細胞約含5000~50000個核糖體，部分附著在細胞膜內側，大部分游離于細胞質中。

細菌核糖體的沉降系數(shù)為70s，由大亞單位（50s）與小亞單位（30s）組成，大亞單位含有23srrna,5srrna與30多種蛋白質，小亞單位含有16srrna與20多種蛋白質。30s的小亞單位對四環(huán)素與鏈霉素很敏感，50s的大亞單位對紅霉素與氯霉素很敏感。

細菌核區(qū)dna以外的，可進行自主復制的遺傳因子，稱為質粒（plasmid）。質粒是裸露的環(huán)狀雙鏈dna分子，所含遺傳信息量為2~200個基因，能進行自我復制，有時能整合到核dna中去。

質粒dna在遺傳工程研究中很重要，常用作基因重組與基因轉移的載體。 胞質顆粒是細胞質中的顆粒，起暫時貯存營養(yǎng)物質的作用，包括多糖、脂類、多磷酸鹽等。

（四）其他結構 許多細菌的最外表還覆蓋著一層多糖類物質，邊界明顯的稱為莢膜（capsule），如肺炎球菌，邊界不明顯的稱為粘液層（slime layer），如葡萄球菌。莢膜對細菌的生存具有重要意義，細菌不僅可利用莢膜抵御不良環(huán)境；保護自身不受白細胞吞噬；而且能有選擇地粘附到特定細胞的表面上，表現(xiàn)出對靶細胞的專一攻擊能力。

例如，傷寒沙門桿菌能專一性地侵犯腸道淋巴組織。細菌莢膜的纖絲還能把細菌分泌的消化酶貯存起來，以備攻擊靶細胞之用。

鞭毛是某些細菌的運動器官，由一種稱為鞭毛蛋白（flagellin）的彈性蛋白構成，結構上不同于真核生物的鞭毛。細菌可以通過調整鞭毛旋轉的方向（順和逆時針）來改變運動狀態(tài)。

菌毛是菌體表面極其的蛋白纖細，須用電鏡觀察。特點是：細、短、直、硬、多，菌毛與細菌運動無關，根據形態(tài)、結構和功能，可分為普通菌毛和性菌毛兩類。

前者與細菌吸附和侵染宿主有關，后者為中空管子，與傳遞遺傳物質有關。 （五）繁殖 細菌一二分裂的方式繁殖，某些細菌處于不利的環(huán)境，或耗盡營養(yǎng)時，形成內生孢子，又稱芽孢，是對不良環(huán)境有強抵抗力的休眠體，由于芽胞在細菌細胞內形成，故常稱為內生孢子。

芽孢的生命力非常頑強，有些湖底沉積土中的芽抱桿茵經500-1000年后仍有活力，肉毒梭菌的芽孢在ph 7.0時能耐受100℃煮沸5-9.5小。