檢驗(yàn)蛋白質(zhì)含量的方法方法(測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法,其原理各是什么)
1.測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法有哪些,其原理各是什么
Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度 （一）實(shí)驗(yàn)原理 雙縮脲法（Biuret法）和Folin—酚試劑法（Lowry法）的明顯缺點(diǎn)和許多限制，促使科學(xué)家們?nèi)ふ腋玫牡?白質(zhì)溶液測(cè)定的方法。
1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法（Bradford法），是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計(jì)的。這種蛋白 質(zhì)測(cè)定法具有超過(guò)其他幾種方法的突出優(yōu)點(diǎn)，因而正在得到廣泛的應(yīng)用。
這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測(cè)定 法。 考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置（?max），由465nm變?yōu)?95n m，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。
在595nm下測(cè)定的吸光度值A(chǔ)595，與蛋白質(zhì)濃度成正比。 Bradford法的突出優(yōu)點(diǎn)是： （1）靈敏度高，據(jù)估計(jì)比Lowry法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測(cè)量可達(dá)1?g。
這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生 的顏色變化很大，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry法要大的 多。 （2）測(cè)定快速、簡(jiǎn)便，只需加一種試劑。
完成一個(gè)樣品的測(cè)定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的 過(guò)程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。
因而完全不用像Lowry法那樣費(fèi)時(shí)和嚴(yán)格地控制時(shí)間。 （3）干擾物質(zhì)少。
如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不 干擾此測(cè)定法。
2.常用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法有哪些
1、凱氏定氮法
凱氏定氮法是測(cè)定化合物或混合物中總氮量的一種方法。即在有催化劑的條件下，用濃硫酸消化樣品將有機(jī)氮都轉(zhuǎn)變成無(wú)機(jī)銨鹽，然后在堿性條件下將銨鹽轉(zhuǎn)化為氨，隨水蒸氣蒸餾出來(lái)并為過(guò)量的硼酸液吸收，再以標(biāo)準(zhǔn)鹽酸滴定，就可計(jì)算出樣品中的氮量。
由于蛋白質(zhì)含氮量比較恒定，可由其氮量計(jì)算蛋白質(zhì)含量，故此法是經(jīng)典的蛋白質(zhì)定量方法。
優(yōu)點(diǎn)：可用于所有食品的蛋白質(zhì)分析中；操作相對(duì)比較簡(jiǎn)單；實(shí)驗(yàn)費(fèi)用較低；結(jié)果準(zhǔn)確，是一種測(cè)定蛋白質(zhì)的經(jīng)典方法；用改進(jìn)方法（微量凱氏定氮法）可測(cè)定樣品中微量的蛋白質(zhì)。
缺點(diǎn)：凱氏定氮法只是一個(gè)氧化還原反應(yīng)，把低價(jià)氮氧化并轉(zhuǎn)為氨鹽來(lái)測(cè)定，而不能把高價(jià)氮還原為氮鹽的形式，所以不可以測(cè)出物質(zhì)中所有價(jià)態(tài)的氮含量。
2、雙縮脲法
雙縮脲法是一個(gè)用于鑒定蛋白質(zhì)的分析方法。雙縮脲試劑是一個(gè)堿性的含銅試液，呈藍(lán)色，由1%氫氧化鉀、幾滴1%硫酸銅和酒石酸鉀鈉配制。
當(dāng)?shù)孜镏泻须逆I時(shí)（多肽），試液中的銅與多肽配位，配合物呈紫色?？赏ㄟ^(guò)比色法分析濃度，在紫外可見(jiàn)光譜中的波長(zhǎng)為540nm。鑒定反應(yīng)的靈敏度為5-160mg/ml。鑒定反應(yīng)蛋白質(zhì)單位1-10mg。
優(yōu)點(diǎn)：測(cè)定速度較快，干擾物質(zhì)少，不同蛋白質(zhì)產(chǎn)生的顏色深淺相近。
缺點(diǎn)：①靈敏度差；?②?三羥甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA等會(huì)干擾該反應(yīng)。
3、酚試劑法
取6支試管分別標(biāo)號(hào)，前5支試管分別加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，最后一支試管加待測(cè)蛋白質(zhì)溶液，不加標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，在室溫下放置30分鐘，以未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對(duì)照，于650nm波長(zhǎng)處測(cè)定各管中溶液的吸光度值。
優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，對(duì)水溶性蛋白質(zhì)含量的測(cè)定很有效。
缺點(diǎn)：①費(fèi)時(shí)，要精確控制操作時(shí)間；②酚法試劑的配制比較繁瑣。
4、紫外吸收法
大多數(shù)蛋白質(zhì)在280nm波長(zhǎng)處有特征的最大吸收，這是由于蛋白質(zhì)中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在，可用于測(cè)定0.1~0.5mg/mL含量的蛋白質(zhì)溶液。
取9支試管分別標(biāo)號(hào)，前8支試管分別加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，1號(hào)試管不加標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，最后一支試管加待測(cè)蛋白質(zhì)溶液，而不加標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，每支試管液體總量通過(guò)加入蒸餾水補(bǔ)足而保持一致，將液體混合均勻，在280nm波長(zhǎng)處進(jìn)行比色，記錄吸光度值。
優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、靈敏、快速，不消耗樣品，測(cè)定后能回收。?
缺點(diǎn)：①測(cè)定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確度較差，專(zhuān)一性差；?②干擾物質(zhì)多，若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物質(zhì)，會(huì)出現(xiàn)較大的干擾。
5、考馬斯亮藍(lán)法
考馬斯亮藍(lán)顯色法的基本原理是根據(jù)蛋白質(zhì)可與考馬斯亮藍(lán)G-250 定量結(jié)合。當(dāng)考馬斯亮藍(lán) G-250 與蛋白質(zhì)結(jié)合后，其對(duì)可見(jiàn)光的最大吸收峰從 465nm 變?yōu)?595nm。
在考馬斯亮藍(lán) G-250 過(guò)量且濃度恒定的情況下，當(dāng)溶液中的蛋白質(zhì)濃度不同時(shí)，就會(huì)有不同量的考馬斯亮藍(lán) G-250 從吸收峰為 465nm 的形式轉(zhuǎn)變成吸收峰為 595nm 的形式，而且這種轉(zhuǎn)變有一定的數(shù)量關(guān)系。
一般情況，當(dāng)溶液中的蛋白質(zhì)濃度增加時(shí)，顯色液在 595nm 處的吸光度基本能保持線(xiàn)性增加，因此可以用考馬斯亮藍(lán) G-250 顯色法來(lái)測(cè)定溶液中蛋白質(zhì)的含量。
優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，測(cè)定快速、簡(jiǎn)便，干擾物質(zhì)少，不受酚類(lèi)、游離氨基酸和緩沖劑、絡(luò)合劑的影響，適合大量樣品的測(cè)定。
缺點(diǎn)：由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此用于不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的偏差。
參考資料來(lái)源：百度百科-蛋白質(zhì)測(cè)定
3.蛋白質(zhì)的檢驗(yàn)方法
蛋白質(zhì)測(cè)定方法： 測(cè)定蛋白質(zhì)的方法可分為兩大類(lèi)： 一類(lèi)是利用蛋白質(zhì)的共性，即含氮量 、肽鍵和折射率測(cè)定蛋白質(zhì)含量 ； 另一類(lèi)是利用蛋白質(zhì)中特定氨基酸殘基、酸性和堿性基團(tuán) 以及芳香基團(tuán)等測(cè)定蛋白質(zhì)含量。
（1） 凱氏定氮法： 是通過(guò)測(cè)出樣品中的總含氮量再乘以相應(yīng)的蛋白質(zhì)系數(shù)而求出蛋白質(zhì)的含量，由于樣品中含有少量非蛋白質(zhì)含氮化合物，故此法的結(jié)果稱(chēng)為粗蛋白質(zhì)含量。（是食品上蛋白質(zhì)含量測(cè)定最常用的方法） （2） 雙縮脲法 （3） 染料結(jié)合法 （4） 酚試劑法：方法簡(jiǎn)便快速，故多用于生產(chǎn)單位質(zhì)量控制分析。
（5） 紫外分光光度法-近紅外光譜法。
4.蛋白質(zhì)定量測(cè)定的方法有哪些
定氮法，雙縮尿法（Biuret法）、Folin-酚試劑法（Lowry法）和紫外吸收法。考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）。
凱氏定氮 靈敏度低，適用于0.2~ 1.0mg氮，誤差為 ±2% 費(fèi)時(shí)
8~10小時(shí) 將蛋白氮轉(zhuǎn)化為氨，用酸吸收后滴定 非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)而分離） 用于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確測(cè)定；干擾少；費(fèi)時(shí)太長(zhǎng)
雙縮脲法（Biuret法） 靈敏度低 1~20mg 中速 20~30分鐘 多肽鍵+堿性Cu2+?紫色絡(luò)合物 硫酸銨；Tris緩沖液；某些氨基酸 用于快速測(cè)定，但不太靈敏；不同蛋白質(zhì)顯色相似
紫外吸收法 較為靈敏 50~100mg 快速 5~10分鐘 蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸殘基在280nm處的光吸收 各種嘌吟和嘧啶；
Folin-酚試劑法（Lowry法） 靈敏度高 ~5mg 慢速 40~60分鐘 雙縮脲反應(yīng)；磷鉬酸-磷鎢酸試劑被Tyr和Phe還原 硫酸銨；Tris緩沖液；甘氨酸；
各種硫醇 耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)；操作要嚴(yán)格計(jì)時(shí)；顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化
考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法） 靈敏度最高 1~5mg 快速5~15分鐘 考馬斯亮藍(lán)染料與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，其lmax由465nm變?yōu)?95nm 強(qiáng)堿性緩沖液；
SDS 最好的方法；干擾物質(zhì)少；顏色穩(wěn)定； 顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化
