(1)顯微觀(guān)察法,如觀(guān)察植物細胞有絲分裂、觀(guān)察葉綠體和細胞質(zhì)流動(dòng)、觀(guān)察植物細胞質(zhì)壁分離和復原實(shí)驗等.
(2)觀(guān)色法,如觀(guān)察動(dòng)物毛色和植物花色的遺傳等.
(3)原子示綜法,如噬菌體浸染細菌的實(shí)驗,用18O2和14CO2追蹤光合作用中氧原子和碳原子轉移途徑的實(shí)驗等.
(4)等組實(shí)驗法,如小麥淀粉酶催化淀粉水解的實(shí)驗,發(fā)現生長(cháng)素的燕麥胚芽鞘實(shí)驗等.
(5)加法創(chuàng )意法,如用飼喂法研究甲狀腺激素,用注射法研究動(dòng)物胰島素和生長(cháng)激素,用移植法研究性激素等.
(6)減法創(chuàng )意法,如用閹割法、摘除法研究性激素、甲狀腺激素和生長(cháng)激素的實(shí)驗,雌蕊受粉后除去正在發(fā)育著(zhù)的種子等.
(7)雜交實(shí)驗法,如孟德?tīng)柊l(fā)現遺傳定律的植物雜交、測交的實(shí)驗,小麥的雜交等.
(8)化學(xué)分析法,如番茄和水稻對Ca和Si選擇性吸收,葉綠體中色素的提取和分離實(shí)驗等.
(9)理論分析法,如大、小兩種草履蟲(chóng)競爭的實(shí)驗,植物根向地生長(cháng)、莖背地生長(cháng)的實(shí)驗,植物向光性實(shí)驗等.
(10)模擬實(shí)驗法,如滲透作用的實(shí)驗裝置,分離定律的模擬實(shí)驗等
1.顯微觀(guān)察法:如“觀(guān)察細胞有絲分裂”“觀(guān)察葉綠體和細胞質(zhì)流動(dòng)”“用顯微鏡觀(guān)察多種多樣的細胞”等.
2.觀(guān)色法:如“生物組織中還原糖、脂肪和蛋白質(zhì)的鑒定”“觀(guān)察動(dòng)物毛色和植物花色的遺傳”“DNA和RNA的分布”等.
3.同位素標記法(元素示蹤法):如“噬菌體浸染細菌的實(shí)驗”“恩格爾曼實(shí)驗”等.
4.補充法:如用飼喂法研究甲狀腺激素,用注射法研究動(dòng)物胰島素和生長(cháng)激素,用移植法研究性激素等.
5.摘除法:如用“閹割法、摘除法研究性激素、甲狀腺激素或生長(cháng)激素的作用”“雌蕊受粉后除去正在發(fā)育著(zhù)的種子”等.
6.雜交法:如植物的雜交、測交實(shí)驗等.
7.化學(xué)分析法:如“番茄對Ca和Si的選擇吸收”“葉綠體中色素的提取和分離”等.
8.理論分析法:如“大、小兩種草履蟲(chóng)的競爭實(shí)驗”“植物向性動(dòng)物的研究”等.
9.模擬實(shí)驗法:如“滲透作用的實(shí)驗裝置”“分離定律的模擬實(shí)驗”等.
10.引流法:臨時(shí)裝片中液體的更換,用吸水紙在一側吸引,于另一側滴加換進(jìn)的液體.
1.實(shí)驗方法
實(shí)驗方法是整個(gè)實(shí)驗設計的精髓,是做好實(shí)驗設計的關(guān)鍵所在。現將與中學(xué)實(shí)驗有關(guān)的一些最常見(jiàn)的經(jīng)典的實(shí)驗方法匯總如下:
(1)化學(xué)物質(zhì)的檢測方法:
①淀粉——碘液
②還原糖——斐林試劑、班氏試劑
③CO2——Ca(OH)2溶液或酸堿指示劑
④乳酸——pH試紙
⑤O2——余燼復燃
⑥無(wú)O2——火焰熄滅
⑦蛋白質(zhì)——雙縮脲試劑
⑧染色體——龍膽紫、醋酸洋紅溶液
⑨DNA——二苯胺試劑
⑩脂肪——蘇丹Ⅲ或蘇丹Ⅳ染液
(2)實(shí)驗結果的顯示方法:
①光合速率——O2釋放量或CO2吸收量或淀粉產(chǎn)生量
②呼吸速率——O2吸收量或CO2釋放量或淀粉減少量
③原子途徑——放射性同位素示蹤法
④細胞液濃度大小——質(zhì)壁分離
⑤細胞是否死亡——質(zhì)壁分離
⑥甲狀腺激素作用——動(dòng)物耗氧量,發(fā)育速度等
⑦生長(cháng)激素作用——生長(cháng)速度(體重變化,身高變化)
⑧胰島素作用——動(dòng)物活動(dòng)狀態(tài)
⑨菌量——菌落數或亞甲基藍溶液褪色程度
⑩大腸桿菌——伊紅—美藍瓊脂培養基
(3)實(shí)驗條件的控制方法:
①增加水中氧氣——泵入空氣或吹氣或放入綠色植物
②減少水中氧氣——容器密封或油膜覆蓋或用涼開(kāi)水
③除去容器中CO2——NaOH溶液
④除去葉片中原有淀粉——置于黑暗環(huán)境
⑤除去葉片中葉綠素——酒精隔水加熱
⑥除去光合作用對呼吸作用的干擾——給植株遮光
⑦如何得到單色光——棱鏡色散或彩色薄膜濾光
⑧血液抗凝——加入檸檬酸鈉
⑨線(xiàn)粒體提取——細胞勻漿離心
⑩骨的脫鈣——鹽酸溶液
⑾滅菌方法——微生物培養的關(guān)鍵在于滅菌,對不同材料,滅菌方法不同:培養基用高壓蒸氣滅菌;接種環(huán)用火焰灼燒滅菌;雙手用肥皂洗凈,擦干后用75%酒精消毒;整個(gè)接種過(guò)程都在實(shí)驗室無(wú)菌區進(jìn)行。
實(shí)驗方法是整個(gè)實(shí)驗設計的精髓,是做好實(shí)驗設計的關(guān)鍵所在.現將與中學(xué)實(shí)驗有關(guān)的一些最常見(jiàn)的經(jīng)典的實(shí)驗方法匯總如下:
(1)化學(xué)物質(zhì)的檢測方法:
①淀粉——碘液
②還原糖——斐林試劑、班氏試劑
③CO2——Ca(OH)2溶液或酸堿指示劑
④乳酸——pH試紙
⑤O2——余燼復燃
⑥無(wú)O2——火焰熄滅
⑦蛋白質(zhì)——雙縮脲試劑
⑧染色體——龍膽紫、醋酸洋紅溶液
⑨DNA——二苯胺試劑
⑩脂肪——蘇丹Ⅲ或蘇丹Ⅳ染液
(2)實(shí)驗結果的顯示方法:
①光合速率——O2釋放量或CO2吸收量或淀粉產(chǎn)生量
②呼吸速率——O2吸收量或CO2釋放量或淀粉減少量
③原子途徑——放射性同位素示蹤法
④細胞液濃度大小——質(zhì)壁分離
⑤細胞是否死亡——質(zhì)壁分離
⑥甲狀腺激素作用——動(dòng)物耗氧量,發(fā)育速度等
⑦生長(cháng)激素作用——生長(cháng)速度(體重變化,身高變化)
⑧胰島素作用——動(dòng)物活動(dòng)狀態(tài)
⑨菌量——菌落數或亞甲基藍溶液褪色程度
⑩大腸桿菌——伊紅—美藍瓊脂培養基
(3)實(shí)驗條件的控制方法:
①增加水中氧氣——泵入空氣或吹氣或放入綠色植物
②減少水中氧氣——容器密封或油膜覆蓋或用涼開(kāi)水
③除去容器中CO2——NaOH溶液
④除去葉片中原有淀粉——置于黑暗環(huán)境
⑤除去葉片中葉綠素——酒精隔水加熱
⑥除去光合作用對呼吸作用的干擾——給植株遮光
⑦如何得到單色光——棱鏡色散或彩色薄膜濾光
⑧血液抗凝——加入檸檬酸鈉
⑨線(xiàn)粒體提取——細胞勻漿離心
⑩骨的脫鈣——鹽酸溶液
⑾滅菌方法——微生物培養的關(guān)鍵在于滅菌,對不同材料,滅菌方法不同:培養基用高壓蒸氣滅菌;接種環(huán)用火焰灼燒滅菌;雙手用肥皂洗凈,擦干后用75%酒精消毒;整個(gè)接種過(guò)程都在實(shí)驗室無(wú)菌區進(jìn)行.
(4)實(shí)驗中控制溫度的方法:
①還原糖鑒定:水浴煮沸加熱
②酶促反應:水浴保溫
③用酒精溶解葉中的葉綠素:酒精要隔水加熱
④DNA的鑒定:水浴煮沸加熱
⑤細胞和組織培養以及微生物培養:恒溫培養
細胞固定化方法有:Adsorption(吸附);covalent bonding(共價(jià)結合);Cross linking(交聯(lián));Entrapment(包埋)、Encapsulation(微膠囊) 。下面對這幾種做具體介紹。
一、吸附法
1,原理
利用載體和細胞表面所帶電荷的靜電引力(van der Walls forces),使細胞吸附于載體上。吸附法可分為物理吸附和離子吸附兩種。該法操作簡(jiǎn)單,固定化過(guò)程對細胞活性影響小。
2,載體的材料
采用吸附法固定細胞,所用的載體主要有:硅藻土、木屑、多孔玻璃、活性炭、
多孔陶瓷、離子交換樹(shù)脂和等。塑料
3,影響吸附固定化的因素
(1)Z-電位
(2)細胞的性質(zhì)和細胞壁的組成
(3)載體的性質(zhì)
(4)pH
二、共價(jià)結合法
利用細胞表面的反應基團(如氨基、羧基、羥基、巰基、咪唑基)與活化的無(wú)機或有機載體反應,形成共價(jià)鍵將細胞固定。用該法制備的固定化細胞一般為死細胞。
三、交聯(lián)法
利用雙功能或多功能試劑與細胞表面的反應基團(如氨基、羧基、羥基、巰基、咪唑基)反應,從而使細胞固定。常用的交聯(lián)劑包括:戊二醛、甲苯二異氰酸酯、雙重氮聯(lián)苯胺。
由于交聯(lián)試劑的毒性,這一方法具有一定的局限性。
四、包埋法
包埋法是細胞固定化最常用的方法。包埋法可以分為:
1,微膠囊法:利用半透性聚合物薄膜將細胞包裹起來(lái),形成微型膠囊;
2,凝膠包埋法:是在無(wú)菌條件下,將生物細胞和膠溶液混合在一起,然后再經(jīng)過(guò)相應的造粒處理,形成直徑為1-4mm的膠粒。
常用的包埋劑為:聚丙烯酰胺、瓊脂、海藻酸、卡拉膠、二醋酸纖維、三醋酸纖維、明膠等。
五、固定化方法的比較
吸附法:條件溫和、方法簡(jiǎn)便、載體可再生。但操作穩定性差。
共價(jià)法:操作穩定性高。但由于試劑的毒性,易引起細胞的破壞。
交聯(lián)法:可得到高細胞濃度,但機械強度低,無(wú)法再生,不適于實(shí)際應用。
包埋法:細胞和載體間沒(méi)有束縛,固定化后,細胞仍保持較高活力。但這類(lèi)方法只適用于小分子底物。
根據每個(gè)細胞有一定的重量而設計的。
它可以用于單細胞、多細胞以及絲狀體微生物生長(cháng)的測定。將一定體積的樣品通過(guò)離心或過(guò)濾將菌體分離出來(lái),經(jīng)洗滌,再離心后直接稱(chēng)重,求出濕重,如果是絲狀體微生物,過(guò)濾后用濾紙吸去菌絲之間的自由水,再稱(chēng)重求出濕重。
不論是細菌樣品還是絲狀菌樣品,可以將它們放在已知重量的平皿或燒杯內,于105℃烘干至恒重,取出放入干燥器內冷卻,再稱(chēng)量,求出微生物干重。如果要測定固體培養基上生長(cháng)的放線(xiàn)菌或絲狀真菌,可先加熱至50℃,使瓊脂熔化,過(guò)濾得菌絲體,再用50℃的生理鹽水洗滌菌絲,然后按上述方法求出菌絲體的濕重或干重。
除了干重、濕重反映細胞物質(zhì)重量外,還可以通過(guò)測定細胞中蛋白質(zhì)或DNA的含量反映細胞物質(zhì)的量。蛋白質(zhì)是細胞的主要成分,含量也比較穩定,其中氮是蛋白質(zhì)的重要組成元素。
從一定體積的樣品中分離出細胞,洗滌后,按凱氏定氮法測出總氮量。蛋白質(zhì)含氮量為16%,細菌中蛋白質(zhì)含量占細菌固形物的50%一80%,一般以65%為代表,有些細菌則只占13%一14%,這種變化是由菌齡和培養條件不同所產(chǎn)生的。
因此總含氮量與蛋白質(zhì)總量之間的關(guān)系可按下列公式計算:蛋白質(zhì)總量=含氮量*6.25核酸DNA是微生物的重要遺傳物質(zhì),每個(gè)細菌的DNA含量相當恒定,平均為8.4*`10^(-5)`NG。因此從一定體積的細菌懸液中所含的細菌中提取DNA,求得DNA含量,再計算出這一定體積的細菌懸液所含的細菌總數。
生物實(shí)驗總結 實(shí)驗一 觀(guān)察DNA和RNA在細胞中的分布 實(shí)驗原理:DNA 綠色,RNA 紅色 分布:真核生物DNA主要分布在細胞核中,線(xiàn)粒體和葉綠體內也含有少量的DNA;RNA主要分布在細胞質(zhì)中。
實(shí)驗結果: 細胞核呈綠色,細胞質(zhì)呈紅色. 實(shí)驗二 物質(zhì)鑒定 還原糖 + 斐林試劑 磚紅色沉淀 脂 肪 + 蘇丹III 橘黃色 脂 肪 + 蘇丹IV 紅色 蛋白質(zhì) + 雙縮脲試劑 紫色反應 1、還原糖的檢測 (1)材料的選取:還原糖含量高,白色或近于白色,如蘋(píng)果,梨,白蘿卜。 (2)試劑:斐林試劑(甲液:0.1g/mL的NaOH溶液,乙液:0.05g/mL的CuSO4溶液),現配現用。
(3)步驟:取樣液2mL于試管中→加入剛配的斐林試劑1mL(斐林試劑甲液和乙液等量混合均勻后再加入)→水浴加熱2min左右→觀(guān)察顏色變化(白色→淺藍色→磚紅色) ★模擬尿糖的檢測 1、取樣:正常人的尿液和糖尿病患者的尿液 2、檢測方法:斐林試劑(水浴加熱)或班氏試劑或尿糖試紙 3、結果:(用斐林試劑檢測)試管內發(fā)生出現磚紅色沉淀的是糖尿病患者的尿液,未出現磚紅色沉淀的是正常人的尿液。 4、分析:因為糖尿病患者的尿液中含有還原糖,與斐林試劑發(fā)生反應產(chǎn)生磚紅色沉淀,而正常人尿液中無(wú)還原糖,所以沒(méi)有發(fā)生反應。
2、脂肪的檢測 (1)材料的選取:含脂肪量越高的組織越好,如花生的子葉。 (2)步驟: 制作切片(切片越薄越好)將最薄的花生切片放在載玻片中央 ↓ 染色(滴蘇丹Ⅲ染液2~3滴切片上→2~3min后吸去染液→滴體積分數50%的酒精洗去浮色→吸去多余的酒精) ↓ 制作裝片(滴1~2滴清水于材料切片上→蓋上蓋玻片) ↓ 鏡檢鑒定(顯微鏡對光→低倍鏡觀(guān)察→高倍鏡觀(guān)察染成橘黃色的脂肪顆粒) 3、蛋白質(zhì)的檢測 (1)試劑:雙縮脲試劑(A液:0.1g/mL的NaOH溶液,B液:0.01g/mL的CuSO4溶液) (2)步驟:試管中加樣液2mL→加雙縮脲試劑A液1mL,搖勻→加雙縮尿試劑B液4滴,搖勻→觀(guān)察顏色變化(紫色) 考點(diǎn)提示: (1)常見(jiàn)還原性糖與非還原性糖有哪些? 葡萄糖、果糖、麥芽糖都是還原性糖;淀粉、蔗糖、纖維素都是非還原性糖。
(2 )還原性糖植物組織取材條件? 含糖量較高、顏色為白色或近于白色,如:蘋(píng)果、梨、白色甘藍葉、白蘿卜等。 (3)研磨中為何要加石英砂?不加石英砂對實(shí)驗有何影響? 加石英砂是為了使研磨更充分。
不加石英砂會(huì )使組織樣液中還原性糖減少,使鑒定時(shí)溶液顏色變化不明顯。 (4)斐林試劑甲、乙兩液的使用方法?混合的目的?為何要現混現用? 混合后使用;產(chǎn)生氫氧化銅;氫氧化銅不穩定。
(5)還原性糖中加入斐林試劑后,溶液顏色變化的順序為? 淺藍色 棕色 磚紅色 (6)花生種子切片為何要薄? 只有很薄的切片,才能透光,而用于顯微鏡的觀(guān)察。 (7)轉動(dòng)細準焦螺旋時(shí),若花生切片的細胞總有一部分清晰,另一部分模糊,其原因一般是什么? 切片的厚薄不均勻。
(8)脂肪鑒定中乙醇作用? 洗去浮色。 (9)雙縮脲試劑A、B兩液是否混合后用?先加A液的目的怎樣通過(guò)對比看顏色變化? 不能混合;先加A液的目的是使溶液呈堿性;先留出一些大豆組織樣液做對比。
實(shí)驗三 觀(guān)察葉綠體和細胞質(zhì)流動(dòng) 1、材料:新鮮蘚類(lèi)葉、黑藻葉或菠菜葉,口腔上皮細胞臨時(shí)裝片 2、原理:葉綠體在顯微鏡下觀(guān)察,綠色,球形或橢球形。 用健那綠染液染色后的口腔上皮細胞中線(xiàn)粒體成藍綠色,細胞質(zhì)接近無(wú)色。
知識概要: 取材 制片 低倍觀(guān)察 高倍觀(guān)察 考點(diǎn)提示: (1)為什么可直接取用蘚類(lèi)的小葉,而不能直接取用菠菜葉? 因為蘚類(lèi)的小葉很薄,只有一層細胞組成,而菠菜葉由很多層細胞構成。 (2)取用菠菜葉的下表皮時(shí),為何要稍帶些葉肉? 表皮細胞除保衛細胞外,一般不含葉綠體,而葉肉細胞含較多的葉綠體。
(3)怎樣加快黑藻細胞質(zhì)的流動(dòng)速度?最適溫度是多少? 進(jìn)行光照、提高水溫、切傷部分葉片;25℃左右。 (4)對黑藻什么部位的細胞觀(guān)察,所觀(guān)察到的細胞質(zhì)流動(dòng)的現象最明顯? 葉脈附近的細胞。
(5)若視野中某細胞中細胞質(zhì)的流動(dòng)方向為順時(shí)針,則在裝片中該細胞的細胞質(zhì)的實(shí)際流動(dòng)方向是怎樣的? 仍為順時(shí)針。 (6)是否一般細胞的細胞質(zhì)不流動(dòng),只有黑藻等少數植物的細胞質(zhì)才流動(dòng)? 否,活細胞的細胞質(zhì)都是流動(dòng)的。
(7)若觀(guān)察植物根毛細胞細胞質(zhì)的流動(dòng),則對顯微鏡的視野亮度應如何調節? 視野應適當調暗一些,可用反光鏡的平面鏡來(lái)采光或縮小光圈。 (8)在強光照射下,葉綠體的向光面有何變化?葉綠體的受光面積較小有一面面向光源。
實(shí)驗四 觀(guān)察有絲分裂 1、材料:洋蔥根尖(蔥,蒜) 2、步驟:(一)洋蔥根尖的培養 (二)裝片的制作 制作流程:解離→漂洗→染色→制片 1. 解離: 藥液: 質(zhì)量分數為15%的鹽酸,體積分數為95%的酒精(1 : 1混合液). 時(shí)間: 3~5min .目的: 使組織中的細胞相互分離開(kāi)來(lái). 2. 漂洗: 用清水漂洗約3min. 目的: 洗去藥液,防止解離過(guò)度,并有利于染色. 3. 染色: 用質(zhì)量濃度為0.01g / mL或0.02g / mL的龍膽紫溶液(或醋酸洋紅液)染色3~ 5min 目的: 使染色體著(zhù)色,利于觀(guān)察. 4. 制片: 將根尖放在載玻片上,加一滴清水,并用鑷子把根尖弄碎,蓋上蓋玻片,在蓋玻片上再加一片載玻片. 然后用拇指輕輕地按。
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