細胞復蘇步驟和(細胞凍存與復蘇步驟 原理及注意事項)
1.細胞凍存與復蘇步驟、原理及注意事項
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培養細胞的冷凍保存與復蘇? 概述 |? 凍存過(guò)程 |
? 冷凍保存與復蘇的原理 |? 凍存結果 |
? 冷凍速率 |? 討論 |
? 冷凍保存溫度 |? 凍存細胞的復蘇 |
? 復溫速率 |? 非玻璃化凍存細胞的復蘇 |
? 冷凍保護劑 |? 主要材料 |
? 冷凍保存方法 |? 復蘇過(guò)程 |
? 非玻璃化凍存方法 |? 結果 |
? 主要材料 |? 討論 |
? 凍存過(guò)程 |? 玻璃化凍存細胞的復蘇 |
? 凍存結果 |? 主要材料 |
? 討論 |? 復蘇過(guò)程 |
? 玻璃化凍存方法 |? 結果 |
? 主要材料 |? 討論 |
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Polge等人（1949）發(fā)現了甘油對低溫下貯存的細胞具有保護作用，他們仍然以精子進(jìn)行研究發(fā)現，加入甘油能夠大大提高貯存于-790C下精子的存活率。接下來(lái)的重大進(jìn)展是Luyet(1951)與Lovelock(1953)等多位學(xué)者發(fā)現了電解質(zhì)濃度對貯存細胞的損傷作用。他們的結論是，電解質(zhì)濃度增大是造成貯存細胞損傷的主要原因。冷凍理論后來(lái)得到Merryman(1956)、Rey(1957)以及在不同的冷凍速度既然能使細胞內發(fā)生不同的
2.和注意事項細胞復蘇如何進(jìn)行,有哪些需要注意的事
一、\x09復蘇
1.\x09把凍存管從液氮中取出來(lái)，立即投入37℃水浴鍋中，輕微搖動(dòng).液體都融化后（大概1-1.5分鐘），拿出來(lái)噴點(diǎn)酒精放到超凈工作臺里.
2.\x09把上述細胞懸液吸到裝10ml培養基的15ml的離心管中（用培養基把凍存管洗一遍，把粘在壁上的細胞都洗下來(lái)），1000轉離心5分鐘.
3.\x09把上清液倒掉，加1ml培養基把細胞懸浮起來(lái).吸到裝有10ml培養基的10cm培養皿中前后左右輕輕搖動(dòng)，使培養皿中的細胞均勻分布.
4.\x09標好細胞種類(lèi)和日期、培養人名字等，放到CO2培養箱中培養，細胞貼壁后換培養基.
5.\x093天換一次培養基.
二、\x09傳代
1.\x09培養皿中的細胞覆蓋率達到80%-90%時(shí)要傳代.
2.\x09把原有培養基吸掉.
3.\x09加適當的胰蛋白酶（能覆蓋細胞就行），消化1-2分鐘.
4.\x09細胞都變圓后加如入等體積的含血清的培養基終止消化.
5.\x09用移液槍吹打細胞，把細胞都懸浮起來(lái).
6.\x09把細胞吸到15ml的離心管中，1000轉離心5分鐘.
7.\x09倒掉上清液，加1-2ml培養基，把細胞都吹起來(lái).
8.\x09根據細胞種類(lèi)把細胞傳到幾個(gè)培養皿中.一般，癌細胞分5個(gè)，正常細胞傳3個(gè).繼續培養.
三、\x09 凍存
把細胞消化下來(lái)并離心（同上）.用配好的凍存液把細胞懸浮起來(lái)，分裝到滅菌的凍存管中，靜止幾分鐘，寫(xiě)明細胞種類(lèi)，凍存日期.4℃ 30min,-20℃ 30min,-80℃過(guò)夜，然后放到液氮灌中保存.
凍存液的配制：70%的完全培養基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加，邊滴邊搖.
要注意的就是無(wú)菌操作！
3.求細胞復蘇方法步驟和注意事項
博凌科為解答：【材料】1.常規細胞培養儀器設備 恒溫水浴振蕩器。
2.培養液（DMEM）胎牛血清（CBS）二甲基亞砜（DMSO）【操作程序】1.細胞實(shí)驗室進(jìn)行常規消毒，紫外照射40min以上。2.培養液（DMEM）、0.25%胰蛋白酶（Trypsin）恒溫水浴箱370C預熱20min，備用。
3.二甲基亞砜（DMSO）在40C冰箱中冷藏30min，備用。4.從液氮保存罐中取出凍存管，立即放入400C水浴中，快速搖晃，直至凍存液完全融化。
5.將細胞懸液移入15ml離心管，緩慢加入4ml培養液，離心（1000r/min,5min）。6.用培養液懸液混懸沉淀細胞，調整細胞濃度，方培養箱中培養。
7.記錄復蘇日期。【注意事項】1.取細胞的過(guò)程中注意帶好防凍手套，護目鏡。
此項尤為重要，細胞凍存管可能漏入液氮，解凍時(shí)凍存管中的氣溫急劇上升，可導致爆炸。2.凍存液的問(wèn)題：凍存液的配置已是常識，在這里不作詳述，但二甲基亞砜（DMSO）對細胞不是完全無(wú)毒副作用，在常溫下，二甲基亞砜對細胞的毒副作 較大，因此，必須在1-2min內使凍存液完全融化。
如果復蘇溫度太慢，會(huì )造成細胞的損傷，二甲基亞砜（DMSO）最好選擇進(jìn)口產(chǎn)品。3.離心前須加入少量培養液。
細胞解凍后二甲基亞砜濃度較高，注意加入少量培養液可稀釋其濃度，以減少對細胞的損傷。4.離心問(wèn)題：目前主要有兩種見(jiàn)解。
一種是解凍后的細胞懸液直接吹打均勻后分裝到培養瓶中進(jìn)行培養，第二天換液。因為離心的目的是兩個(gè)，去除 DMSO，去除死細胞，這個(gè)是標準流程，但對一般人來(lái)說(shuō)，把握不好離心轉速和時(shí)間，轉的不夠活細胞沉底的少，細胞就全被扔掉了，轉過(guò)了活細胞會(huì )受壓過(guò)大， 死亡。
此外在操作過(guò)程中容易污染，所以不推薦。另一種說(shuō)法為細胞懸液中含有二甲基亞砜（DMSO）,DMSO對細胞有一定的毒副作用，所以須將離心后的液 體前倒凈，且一定倒干凈。
我在試驗中按照常規的離心分裝的方法進(jìn)行復蘇，結果無(wú)有異常。5.細胞貼壁少的問(wèn)題：教科書(shū)中說(shuō)明凍存細胞解凍時(shí)1ml細胞液要加10ml-15m培養液，而在我的試驗中的經(jīng)驗總結為培養基越少細胞越容易貼附。
6.復蘇細胞分裝的問(wèn)題：試驗中我的經(jīng)驗總結為復蘇1管細胞一般可分裝到1-2只培養瓶中，分裝過(guò)多，細胞濃度過(guò)低，不利于細胞的貼壁。7.加培養基的量放入問(wèn)題：這個(gè)量的多少的把握主要涉及到的問(wèn)題是DMSO的濃度，從如果你加培養基的太少，那么DMSO的濃度就會(huì )比較大，就會(huì )影響 細胞生長(cháng)，從以前的資料來(lái)看，DMSO的濃度在小于0.5%的時(shí)候對一般細胞沒(méi)有什么影響，還有一個(gè)說(shuō)法是1%。
所以如果你的凍存液的濃度是 10%DMSO的話(huà)那么加10ml以上的培養基就恰好稀釋到了無(wú)害濃度。
4.細胞的凍存與復蘇要注意什么 – 手機愛(ài)問(wèn)
細胞凍存與復蘇步驟注意事項一、原理在不加任何條件下直接凍存細胞時(shí)，細胞內和外環(huán)境中的水都會(huì )形成冰晶，能導致細胞內發(fā)生機械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、PH改變、蛋白變性等，能引起細胞死亡。
如向培養液加入保護劑，可使冰點(diǎn)降低。在緩慢的凍結條件下，能使細胞內水份在凍結前透出細胞。
貯存在-130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。細胞復蘇時(shí)速度要快，使之迅速通過(guò)細胞最易受損的-5~0℃，細胞仍能生長(cháng)，活力受損不大。
目前常用的保護劑為二甲亞砜（DMSO）和甘油，它們對細胞無(wú)毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細胞。二、操作步驟（一）凍存1、消化細胞（同實(shí)驗二），將細胞懸液收集至離心管中。
2、1000rpm離心10分鐘，棄上清液。3、沉淀加含保護液的培養，計數，調整至5*106/ml左右。
4、將懸液分至凍存管中，每管1 ml。5、將凍存管口封嚴。
如用安瓿瓶則火焰封口，封口一定要嚴，否則復蘇時(shí)易出現爆裂。6、貼上標簽，寫(xiě)明細胞種類(lèi)，凍存日期。
凍存管外拴一金屬重物和一細繩。7、按下列順序降溫：室溫→4℃（20分鐘〕→冰箱冷凍室（30分鐘）→低溫冰箱（-30℃ 1小時(shí)）→氣態(tài)氮（30分鐘）→液氮。
注意：操作時(shí)應小心，以免液氮凍傷。液氮定期檢查，隨時(shí)補充，絕對不能揮發(fā)干凈，一般30立升的液氮能用1~1.5月。
（二）復蘇1. 細胞實(shí)驗室進(jìn)行常規消毒，紫外照射40min以上。2. 培養液（DMEM）、0.25%胰蛋白酶（Trypsin）恒溫水浴箱370C預熱20min，備用。
3. 二甲基亞砜（DMSO）在40C冰箱中冷藏30min，備用。4. 從液氮保存罐中取出凍存管，立即放入400C水浴中，快速搖晃，直至凍存液完全融化。
5. 將細胞懸液移入15ml離心管，緩慢加入4ml培養液，離心（1000r/min,5min）。6. 用培養液懸液混懸沉淀細胞，調整細胞濃度，方培養箱中培養。
7. 記錄復蘇日期。【注意事項】1. 取細胞的過(guò)程中注意帶好防凍手套，護目鏡。
此項尤為重要，細胞凍存管可能漏入液氮，解凍時(shí)凍存管中的氣溫急劇上升，可導致爆炸。2. 凍存液的問(wèn)題：凍存液的配置已是常識，在這里不作詳述，但二甲基亞砜（DMSO）對細胞不是完全無(wú)毒副作用，在常溫下，二甲基亞砜對細胞的毒副作 較大，因此，必須在1-2min內使凍存液完全融化。
如果復蘇溫度太慢，會(huì )造成細胞的損傷，二甲基亞砜（DMSO）最好選擇進(jìn)口產(chǎn)品。3. 離心前須加入少量培養液。
細胞解凍后二甲基亞砜濃度較高，注意加入少量培養液可稀釋其濃度，以減少對細胞的損傷。4. 離心問(wèn)題：目前主要有兩種見(jiàn)解。
一種是解凍后的細胞懸液直接吹打均勻后分裝到培養瓶中進(jìn)行培養，第二天換液。因為離心的目的是兩個(gè)，去除 DMSO，去除死細胞，這個(gè)是標準流程，但對一般人來(lái)說(shuō)，把握不好離心轉速和時(shí)間，轉的不夠活細胞沉底的少，細胞就全被扔掉了，轉過(guò)了活細胞會(huì )受壓過(guò)大， 死亡。
此外在操作過(guò)程中容易污染，所以不推薦。另一種說(shuō)法為細胞懸液中含有二甲基亞砜（DMSO）,DMSO對細胞有一定的毒副作用，所以須將離心后的液 體前倒凈，且一定倒干凈。
我在試驗中按照常規的離心分裝的方法進(jìn)行復蘇，結果無(wú)有異常。5. 細胞貼壁少的問(wèn)題：教科書(shū)中說(shuō)明凍存細胞解凍時(shí)1ml細胞液要加10ml-15m培養液，而在我的試驗中的經(jīng)驗總結為培養基越少細胞越容易貼附。
6. 復蘇細胞分裝的問(wèn)題：試驗中我的經(jīng)驗總結為復蘇1管細胞一般可分裝到1-2只培養瓶中，分裝過(guò)多，細胞濃度過(guò)低，不利于細胞的貼壁。7. 加培養基的量放入問(wèn)題：這個(gè)量的多少的把握主要涉及到的問(wèn)題是DMSO的濃度，從如果你加培養基的太少，那么DMSO的濃度就會(huì )比較大，就會(huì )影響 細胞生長(cháng)，從以前的資料來(lái)看，DMSO的濃度在小于0.5%的時(shí)候對一般細胞沒(méi)有什么影響，還有一個(gè)說(shuō)法是1%。
所以如果你的凍存液的濃度是 10%DMSO的話(huà)那么加10ml以上的培養基就恰好稀釋到了無(wú)害濃度。
5.心肺復蘇基本步驟和注意事項
樓主你好；
心肺復蘇ABC步驟；
A 開(kāi)放氣道
拍搖患者并大聲詢(xún)問(wèn)，手指甲掐壓人中穴約五秒，如無(wú)反應表示意識喪失。這時(shí)應使患者水平仰臥，解開(kāi)頸部鈕扣，注意清除口腔異物，使患者仰頭抬頦，用耳貼近口鼻，如未感到有氣流或胸部無(wú)起伏，則表示已無(wú)呼吸。
B 口對口人工 呼吸
在保持患者仰頭抬頦前提下，施救者用一手捏閉的鼻孔 （或口唇 ），然后深吸一大口氣，迅速用力向患者口 （或鼻 ）內吹 氣 ， 然后放松鼻孔（或口唇），照此每5秒鐘反復一次，直到恢復自主呼吸。
每次吹氣間隔1.5秒，在這個(gè)時(shí)間搶救者應自己深呼吸一次，以便繼續口對口呼吸，直至專(zhuān)業(yè)搶救人員的到來(lái)。
C 人工循環(huán)
檢查心臟是否跳動(dòng)，最簡(jiǎn)易、最可靠的是頸動(dòng)脈。搶救者用2-3個(gè)手指放在患者氣管與頸部肌肉間輕輕按壓，時(shí)間不少于10秒。
如患者停止心跳，搶救者應握緊拳頭，拳眼向上，快速有力猛擊患者胸骨正中下段一次。此舉有可能使患者心臟復跳，如一次不成功可按上述要求再次扣擊一次。
如心臟不能復跳，就要通過(guò)胸外按壓，使心臟和大血管血液產(chǎn)生流動(dòng)。以維持心、腦等主要器官最低血液需要量。
選擇胸外心臟按壓部位：先以右手的中指、示指定出肋骨下緣，而后將右手掌側放在胸骨下1/3，再將左手放在胸骨上方，左手拇指鄰近右手指，使左手掌底部在劍突上。右手置于左手上，手指間互相交錯或伸展。按壓力量經(jīng)手跟而向下，手指應抬離胸部。
·胸外心臟按壓方法：急救者兩臂位于病人胸骨的正上方，雙肘關(guān)節伸直，利用上身重量垂直下壓，對中等體重的成人下壓深度為3—4厘米，而后迅速放松，解除壓力，讓胸廓自行復位。如此有節奏地反復進(jìn)行，按壓與放松時(shí)間大致相等，頻率為每分鐘80—100次。
一人心肺復蘇方法：當只有一個(gè)急救者給病人進(jìn)行心肺復蘇術(shù)時(shí)，應是每做30次胸心臟按壓，交替行2次人工呼吸。
二人心肺復蘇方法：當有兩個(gè)急救者給病人進(jìn)行心肺復蘇術(shù)時(shí)，首先兩個(gè)人應呈對產(chǎn)位置，以便于互相交換。此時(shí)，一個(gè)人做胸外心臟按壓；另一個(gè)人做人工呼吸。兩人可以數著(zhù)1、2、3進(jìn)行配合，每按壓心臟30次，口對口或口對鼻人工呼吸2次。）
注意事項 ；
1、口對口吹氣量不宜過(guò)大，一般不超過(guò)1200毫升，胸廓稍起伏即可。吹氣時(shí)間不宜過(guò)長(cháng)，過(guò)長(cháng)會(huì )引起急性胃擴張、胃脹氣和嘔吐。吹氣過(guò)程要注意觀(guān)察患（傷）者氣道是否通暢，胸廓是否被吹起。
2、胸外心臟按術(shù)只能在患（傷）者心臟停止跳動(dòng)下才能施行。
3、口對口吹氣和胸外心臟按壓應同時(shí)進(jìn)行，嚴格按吹氣和按壓的比例操作，吹氣和按壓的次數過(guò)多和過(guò)少均會(huì )影響復蘇的成敗。
4、胸外心臟按壓的位置必須準確。不準確容易損傷其他臟器。按壓的力度要適宜，過(guò)大過(guò)猛容易使胸骨骨折，引起氣胸血胸；按壓的力度過(guò)輕，胸腔壓力小，不足以推動(dòng)血液循環(huán)。
5、施行心肺復蘇術(shù)時(shí)應將患（傷）者的衣扣及褲帶解松，以免引起內臟損傷。
2005年底美國心臟學(xué)會(huì )（AHA）發(fā)布了新版CPR急救指南，與舊版指南相比，主要就是按壓與呼吸的頻次由15:2調整為30:2
6.A549細胞的復蘇方法
1.先從液氮罐內迅速拿出需要復蘇的細胞，迅速放入37攝氏度的水浴中，并不停的搖晃，注意瓶口不要碰到水面，以防污染細胞；
2.將盛入37攝氏度水浴中的細胞連同燒杯一起帶入細胞房，待細胞均勻融化后，拿出；
3.將細胞懸液倒入離心管，加入3-4滴完全培養基，放入離心機中離心1500轉（調兩檔），3-4min，觀(guān)察細胞沉淀情況，如果太少，再次離心3-4min;
4.將離心管拿出，倒掉上清液，在離心管中加入2滴培養液，并用彎頭滴管伸入液面以下不斷吹打（注意不要將彎頭伸出液面，以防有氣泡產(chǎn)生，影響細胞生長(cháng)）；
5.將新的細胞培養瓶中加入兩滴管培養液，再將離心管中的細胞轉入新的細胞培養瓶（以防加入時(shí)產(chǎn)生氣泡）并使細胞散步均勻；
6.用酒精擦拭瓶身，顯微鏡觀(guān)察細胞形態(tài)（有透明的圓的細胞漂浮其中），培養瓶上寫(xiě)明日期及培養細胞的名稱(chēng)；
7.將培養瓶的蓋子稍松，放入CO2培養（便于CO2進(jìn)入）待第二天觀(guān)察（細胞一般4小時(shí)貼壁）；
