PRC擴(kuò)增(我想問做PCR擴(kuò)增應(yīng)該注意的事項(xiàng)?)
1.我想問做PCR擴(kuò)增應(yīng)該注意的事項(xiàng)?
注意] 1、整個操作要帶口罩及一次性手套，并盡可能在低溫下操作。
另外，提取上清這步一定要小心，靠近沉淀的部分一定要舍得不要，要不然會有蛋白質(zhì)污染，影響比值 2、加氯仿前的勻漿液可在-70℃保存一個月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。 總mRNA的提?。ㄗ约旱慕?jīng)驗(yàn)） 一、關(guān)于Trizol Reagent需要的試劑 1. Chloroform：氯仿 （分析純） 2. Isoproplyl alcohol：異丙醇（分析純） 3. 75% Ethanol(in DEPC-treated water):75%乙醇。
要求用分析純無水乙醇并用0.01%的DEPC處理過的無Rnase的水稀釋。 4. RNase-free water：無Rnase的水。
方法是：將DEPC按0.01%(V/V)加在d H2O中500ml(50ul)，在37℃過夜，并高壓滅菌即得（150℃ 3小時） 5. 一次性塑料手套 6. 注意：DEPC有致癌之嫌 二、關(guān)于Trizol Reagent的使用過程： 1. Homogenization（勻漿） a. Tissues：組織 每100mg組織勻漿加1mlTrizol試劑，樣品體積不能超過Trizol試劑的10%。 b. Cells Grown in monolayer（單層細(xì)胞接毒后出現(xiàn)病變的） 針對JEV細(xì)胞總RNA的抽提法： BHK21細(xì)胞長成單層后，接毒0.5-1ml（采用大瓶），37℃吸附1h，倒掉，加維持液（含2%的血清和HEPE8的MEM）約5ml，維持天。
出 現(xiàn)75%-100%的病變時，以PBS（預(yù)冷）沖洗細(xì)胞兩次，直接在細(xì)胞瓶中加入Trizol試劑1ml/10cm2，吹吸幾次，以裂解細(xì)胞（細(xì)胞瓶有兩 種常用規(guī)格：大的約45cm2，小的約30cm2，故所用Trizol試劑分別約為4.5ml和3ml。Trizol試劑的加入是依細(xì)胞瓶而定，以蓋滿瓶 底為度，而不是依據(jù)細(xì)胞的數(shù)量，否則可導(dǎo)致DNA的污染）具體方法如下：（樣品一定要新鮮） （1） 組織接入預(yù)冷的EP管中，加入Trizol試劑1ml/10cm2（量一定要加足，否則易污染），混勻，吹吸幾次，以破裂細(xì)胞，置室溫5min，以使核蛋白復(fù)合物徹底分離。
（2） 加氯仿0.2ml（每1ml Trizol試劑加入氯仿0.2ml），蓋好，劇烈震蕩15s，置室溫2-3分鐘。 （3） 4℃離心，10000g*15min，離心后，混合物將分離為底層為淺紅的、中層為酚-氯仿相、上層為無色的水相。
RNA包含在水相中，水相的體積約相當(dāng)于所加的Trizol試劑量的60%。 (4) 仔細(xì)吸取上層水相，移至另一EP管中。
（5） 加0.5ml異丙醇，以沉淀RNA（每1ml Trizol試劑加入0.5ml異丙醇），置室溫10min。 (6) 4℃離心，10000g*10min。
RNA沉淀為一層如凝膠樣透明的小塊附在管底和管壁。 （7） 棄上清液，加入預(yù)冷的75%乙醇1ml（每1ml Trizol試劑加入75%乙醇至少1ml），震蕩，充分洗滌沉淀，4℃離心，5500g*5min。
棄上清液，空氣干燥（或真空干燥）后，沉淀重懸于無 Rnase dH2O中，吹吸幾次，55℃-60℃作用10分鐘以溶解RNA,-70℃保存?zhèn)溆谩?（8） 抽提出的細(xì)胞總RNA干燥后加水50ul，取10ul加無Rnase水990ul，稀釋100倍成1ml。
于0.5cm厚的石英比色杯中，以無Rnase水為對照，在721型紫外分光光度計下檢測，結(jié)果應(yīng)為：A260/280 ratio。
2.PCR擴(kuò)增需要注意的點(diǎn)
1. 引物的質(zhì)量是保證PCR特異性的關(guān)鍵，引物過長或過短均會使特異性降低，以18~30bp為宜；引物中C+G含量宜在50%左右；引物內(nèi)部和引物之間不應(yīng)含有互補(bǔ)序列；引物的堿基順序與非擴(kuò)增區(qū)域的同源性應(yīng)小于70%；引物的3'末端與模板DNA一定要配對，但末端沒有嚴(yán)格的限制，故引物設(shè)計時可在5'末端加上限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和/或啟動密碼ATG等；引物合成后必須純化以去除合成產(chǎn)物中的不完整序列、脫嘌呤產(chǎn)物、堿基修飾鏈等“雜質(zhì)”；引物的終濃度一般為0.2~0.5μmol/L，過低會影響反應(yīng)產(chǎn)量，過高會增加引物二聚或錯配的幾率。
2. Taq DNA聚合酶具有5'→3'聚合酶活性和5'→3'外切酶活性，但無3'-5'外切酶活性，因此對單核苷酸的錯配無校正功能，發(fā)生堿基錯配的幾率為 2.1*10-4左右。然而Taq DNA聚合酶的優(yōu)勢在于反應(yīng)產(chǎn)量高于其他DNA聚合酶。Stratagene推出的Pfu DNA聚合酶一直是研究人員心目中最好的高保真酶，而Pfu DNA聚合酶經(jīng)基因工程改造后，新創(chuàng)出的Pfu Ultra具有更佳的校驗(yàn)活力。數(shù)據(jù)顯示Pfu UltraTM高保真DNA聚合酶的平均錯配率為Pfu DNA聚合酶的1/3，為Taq DNA聚合酶的1/18，是目前保真度最高的PCR酶（保真度=1/錯誤率） （數(shù)據(jù)來源：美國冷泉港實(shí)驗(yàn)室）。
3. Mg2+濃度也是影響反應(yīng)效率和特異性的重要因素之一。Taq DNA聚合酶對Mg2+濃度非常敏感，Mg2+可與模板DNA、引物及dNTP等的磷酸根結(jié)合，不同反應(yīng)體系中應(yīng)適當(dāng)調(diào)整MgCl2的濃度，一般以比 dNTP總濃度高出0.5~1.0mmol/L為宜，Mg2+過量能增加非特異擴(kuò)增。
4. dNTP的濃度過高會增加堿基的錯誤摻入率，使反應(yīng)特異性下降；過低則會導(dǎo)致反應(yīng)速度下降。使用時4種dNTP必須以等當(dāng)量濃度配制，均衡的dNTP有利于減少錯配誤差和提高使用效率。
5. 溫度循環(huán)參數(shù)中應(yīng)特別注意復(fù)性溫度，它決定引物與模板的特異性結(jié)合。退火復(fù)性溫度可根據(jù)引物的長度，通過Tm=4(G+C)+2(A+T) 計算得到。在Tm允許的范圍內(nèi)，選擇較高的退火溫度可大大減少引物與模板之間的非特異結(jié)合。
6. 減低污染的常規(guī)措施：①將PCR試劑、PCR產(chǎn)物及其他分子生物學(xué)試劑分開放置；②應(yīng)保持樣品制備、PCR反應(yīng)液配制與PCR產(chǎn)物分析三個工作區(qū)的獨(dú)立性；③使用陽性和陰性對照；④使用最高質(zhì)量的水配制PCR實(shí)驗(yàn)的所有反應(yīng)試劑；⑤配制好的PCR反應(yīng)試劑應(yīng)分成小包裝儲存，每個包裝僅用于單次實(shí)驗(yàn)；⑥制備樣品、配制試劑及反應(yīng)液時必須戴手套；⑦實(shí)驗(yàn)前一定要認(rèn)真清潔加樣器等。
3.在PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意什么?
PCR產(chǎn)物的電泳檢測時間 一般為48h以內(nèi)，有些最好于當(dāng)日電泳檢測，大于48h后帶型不規(guī)則甚致消失。
假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶 PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量及， ④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。
模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質(zhì)沒有消 化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。⑤模 板核酸變性不徹底。
在酶和引物質(zhì)量好時，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處 理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng) 固定不宜隨意更改。 酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導(dǎo)致假陰性。
需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。 引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不 理想、容易彌散的常見原因。
有些批號的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度 高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴(kuò)增，對策為：①選定一個好的引物合成單 位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。
如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。
④引物設(shè)計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。 Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特 異性，濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。
反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul。或100ul，應(yīng)用多 大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul 后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。
物理原因：變性對PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現(xiàn)假陰性；退火溫度過低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計，檢測一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。
靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會成功的。 假陽性 出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。
引物設(shè)計不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。
需重新設(shè)計引物。 靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。
這種假陽性可用以下方法解決：操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。
所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。
二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。
出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶 PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶 與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。
二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù) 過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶 則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。
其對策有：必要時重新設(shè)計引 物。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。
降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次 數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法（93℃變性，65℃左右退火與延伸）。
出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶 PCR擴(kuò)增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量 差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。
其對策有：減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。
適當(dāng)降低Mg2+濃 度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。
4.什么叫做prc擴(kuò)增?
PCR是一種體外DNA 擴(kuò)增技術(shù)，是在模板DNA、引物和4種脫氧核苷酸存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的酶促合反應(yīng)，將待擴(kuò)增的DNA片段與其兩側(cè)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈引物經(jīng)“高溫變性——低溫退火——引物延伸”三步反應(yīng)的多次循環(huán)，使DNA片段在數(shù)量上呈指數(shù)增加，從而在短時間內(nèi)獲得我們所需的大量的特定基因片段。
在環(huán)境檢測中，靶核酸序列往往存在于—個復(fù)雜的混合物如細(xì)胞提取液中，且含量很低，對于探測這種復(fù)雜群體中的特異微生物或某個基因，雜交就顯得不敏感。使用PCR技術(shù)可將靶序列放大幾個數(shù)量級，再用探針雜交探測對被擴(kuò)增序列作定性或定量研究分析微生物群體結(jié)構(gòu)。PCR技術(shù)常與其他技術(shù)結(jié)合起來使用， 如RT-PCR、競爭PCR、槽式PCR、RAPf）、ARDRA等。
RT-PCR不僅能檢測出不能培養(yǎng)微生物，還能測量mRNA基因的轉(zhuǎn)錄水平。
競爭性PCR是一種定量PCR，通過向PCR反應(yīng)體系中加入人工構(gòu)建的帶有突變的競爭模板、控制競爭模板的濃度來確定目的模板的濃度，對目的模板作定量研究。
將PCR技術(shù)和限制酶切技術(shù)結(jié)合使用，用限制酶酶切目的基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，通過對酶切產(chǎn)物的分析，探測該基因的多態(tài)性。
RAPD(randomly amplified polymorphic DNA, RAPD)也是應(yīng)用比較廣泛的一項(xiàng)技術(shù)。RAPD是用那些對某—特定基因的非特異性的引物來擴(kuò)增某些片段。RAPD分析用于探測含有混合微生物種群的各種生物反應(yīng)器中的微生物多樣性。用RAPD分析所得到的基因組指紋圖譜在比較一段時間內(nèi)微生物種群的變化以及比較小試規(guī)模和中試規(guī)模的反應(yīng)器方面是有用的，但還不足以用來估測群落的生物多樣性。
5.在PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意什么
1. 引物的質(zhì)量是保證PCR特異性的關(guān)鍵，引物過長或過短均會使特異性降低，以18~30bp為宜；引物中C+G含量宜在50%左右；引物內(nèi)部和引物之間不應(yīng)含有互補(bǔ)序列；引物的堿基順序與非擴(kuò)增區(qū)域的同源性應(yīng)小于70%；引物的3'末端與模板DNA一定要配對，但末端沒有嚴(yán)格的限制，故引物設(shè)計時可在5'末端加上限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和/或啟動密碼ATG等；引物合成后必須純化以去除合成產(chǎn)物中的不完整序列、脫嘌呤產(chǎn)物、堿基修飾鏈等“雜質(zhì)”；引物的終濃度一般為0.2~0.5μmol/L，過低會影響反應(yīng)產(chǎn)量，過高會增加引物二聚或錯配的幾率。
2. Taq DNA聚合酶具有5'→3'聚合酶活性和5'→3'外切酶活性，但無3'-5'外切酶活性，因此對單核苷酸的錯配無校正功能，發(fā)生堿基錯配的幾率為 2.1*10-4左右。然而Taq DNA聚合酶的優(yōu)勢在于反應(yīng)產(chǎn)量高于其他DNA聚合酶。
Stratagene推出的Pfu DNA聚合酶一直是研究人員心目中最好的高保真酶，而Pfu DNA聚合酶經(jīng)基因工程改造后，新創(chuàng)出的Pfu Ultra具有更佳的校驗(yàn)活力。數(shù)據(jù)顯示Pfu UltraTM高保真DNA聚合酶的平均錯配率為Pfu DNA聚合酶的1/3，為Taq DNA聚合酶的1/18，是目前保真度最高的PCR酶（保真度=1/錯誤率） （數(shù)據(jù)來源：美國冷泉港實(shí)驗(yàn)室）。
3. Mg2+濃度也是影響反應(yīng)效率和特異性的重要因素之一。Taq DNA聚合酶對Mg2+濃度非常敏感，Mg2+可與模板DNA、引物及dNTP等的磷酸根結(jié)合，不同反應(yīng)體系中應(yīng)適當(dāng)調(diào)整MgCl2的濃度，一般以比 dNTP總濃度高出0.5~1.0mmol/L為宜，Mg2+過量能增加非特異擴(kuò)增。
4. dNTP的濃度過高會增加堿基的錯誤摻入率，使反應(yīng)特異性下降；過低則會導(dǎo)致反應(yīng)速度下降。使用時4種dNTP必須以等當(dāng)量濃度配制，均衡的dNTP有利于減少錯配誤差和提高使用效率。
5. 溫度循環(huán)參數(shù)中應(yīng)特別注意復(fù)性溫度，它決定引物與模板的特異性結(jié)合。退火復(fù)性溫度可根據(jù)引物的長度，通過Tm=4(G+C)+2(A+T) 計算得到。
在Tm允許的范圍內(nèi)，選擇較高的退火溫度可大大減少引物與模板之間的非特異結(jié)合。6. 減低污染的常規(guī)措施：①將PCR試劑、PCR產(chǎn)物及其他分子生物學(xué)試劑分開放置；②應(yīng)保持樣品制備、PCR反應(yīng)液配制與PCR產(chǎn)物分析三個工作區(qū)的獨(dú)立性；③使用陽性和陰性對照；④使用最高質(zhì)量的水配制PCR實(shí)驗(yàn)的所有反應(yīng)試劑；⑤配制好的PCR反應(yīng)試劑應(yīng)分成小包裝儲存，每個包裝僅用于單次實(shí)驗(yàn)；⑥制備樣品、配制試劑及反應(yīng)液時必須戴手套；⑦實(shí)驗(yàn)前一定要認(rèn)真清潔加樣器等。
6.PCR加樣有什么需要注意的
實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng) 盡管擴(kuò)增序列的殘留污染大部分是假陽性反應(yīng)的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。因此，不僅要在進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)是謹(jǐn)慎認(rèn)真，在樣品的收集、抽提和擴(kuò)增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)該注意：
1. 戴一次性手套，若不小心濺上反應(yīng)液，立即更換手套；
2. 使用一次性吸頭，嚴(yán)禁與PCR產(chǎn)物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染；
3. 避免反應(yīng)液飛濺，打開反應(yīng)管時為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應(yīng)立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面；
4. 操作多份樣品時，制備反應(yīng)混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應(yīng)的精確度；
5. 最后加入反應(yīng)模板，加入后蓋緊反應(yīng)管；
6. 操作時設(shè)立陰陽性對照和空白對照，即可驗(yàn)證PCR反應(yīng)的可靠性，又可以協(xié)助判斷擴(kuò)增系統(tǒng)的可信性；
7. 盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器最容易受產(chǎn)物氣溶膠或標(biāo)本DNA的污染，最好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過程中加樣器應(yīng)該專用，不能交叉使用，尤其是PCR產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區(qū)；
8. 重復(fù)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證結(jié)果，慎下結(jié)論。
7.PCR實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)有哪些
1、必須在無菌無塵環(huán)境下進(jìn)行操作；
2、檢測人員必須通過國家臨檢中心業(yè)務(wù)培訓(xùn)并取得合格證書；
3、必須擁有標(biāo)準(zhǔn)的的PCR熒光實(shí)驗(yàn)室；
4、后PCR區(qū)PCR完成以后，應(yīng)該留出一個專門用于反應(yīng)后處理樣品的地方。
擴(kuò)展資料
PCR實(shí)驗(yàn)特點(diǎn)：
1、靈敏度高：PCR實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能從100萬個細(xì)胞中檢出一個靶細(xì)胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達(dá)3個RFU；在細(xì)菌學(xué)中最小檢出率為3個細(xì)菌。
2、簡便、快速：PCR實(shí)驗(yàn)反應(yīng)一般在2~4 小時完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。
3、純度要求低：不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA 粗制品及RNA均可作為擴(kuò)增模板。可直接用臨床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等DNA擴(kuò)增檢測。
參考資料來源：百度百科-PCR實(shí)驗(yàn)室
