1.儲存.
收到試劑盒后應盡快放入冷藏室內保存,保存溫度為4℃-8℃.
2.回溫.
試劑盒在使用前應于室溫(22-27℃)下充分回溫,回溫時(shí)間為40-60分鐘.回溫過(guò)程中勿將酶標板的包裝袋開(kāi)封,回溫結束后再將其從包裝袋中取出使用.
3.樣品稀釋.
樣品稀釋?xiě)獓栏癜凑照f(shuō)明書(shū)要求的稀釋倍數進(jìn)行稀釋.如稀釋倍數過(guò)大,可采用多步法進(jìn)行樣品稀釋.例如:試劑盒要求樣品需進(jìn)行500倍稀釋?zhuān)晌?μl樣品加入245μl樣品稀釋液中,充分混勻后,再吸取10μl混合液加入90μl樣品稀釋液中即可.
4.加樣.
稀釋好的樣品在加入酶標板進(jìn)行孵育的過(guò)程中,盡可能縮短第一次加樣和最后一次加樣的時(shí)間間隔,樣品加好后馬上開(kāi)始計時(shí).
5.洗板.
樣品孵育時(shí)間結束后,馬上甩去孔內液體.如多塊酶標板需同時(shí)洗滌,可先將板內液體甩去,倒扣于吸水紙上,再依次進(jìn)行洗滌.使用洗板機洗滌時(shí),建議洗滌次數增加一次.未用完的洗滌液可在4℃-8℃下密封保存1月.
6.顯色.
底物藥片可在顯色前3-5分鐘加入底物緩沖液中,混合直到完全溶解.本試劑最好是現用現配,未用完的底物溶液可在4℃-8℃下避光保存1周.
7.終止及讀數.
提前打開(kāi)酶標儀,加入終止液后立即讀數.
8.同批號試劑盒中的試劑,除酶標二抗及陽(yáng)性對照外,其余均可通用.
9.移液器的正確使用、保存、清潔、校對.
10.實(shí)驗室管理
桌面保持整潔,插槍頭戴手套等.
??jì)?yōu)質(zhì)的試劑,良好的儀器和正確的操作是保證ELISA檢測結果準確可靠的必要條件。
ELISA的操作因固相載體的形成不同而有所差異,國內醫學(xué)檢驗一般均用板式。本文將敘述板式ELISA各個(gè)操作步驟的注意要點(diǎn)(珠式、管式及磁性球ELSIA,國外試劑均與特殊儀器配合應用,兩者均有詳細的使用說(shuō)明,須嚴格遵照規程操作)。
標本的采取和保存 通常我們可用于ELISA檢測的樣本是有多種類(lèi)型的,如血清、血漿、尿液、細胞培養上清或組織勻漿液等,不同類(lèi)型的檢測樣本前期的處理方法是不一樣的。正確的處理樣本是保證ELISA檢測的正確性和準確性的第一步,下面簡(jiǎn)單介紹一下不同類(lèi)型的樣本的處理方法。
血清 血清是最常用于ELISA檢測的一類(lèi)樣本,處理也比較簡(jiǎn)單。 用無(wú)熱原、無(wú)內毒素的試管或離心管采集血液標本,將試管或離心管室溫放置2小時(shí)或4℃過(guò)夜,使血清析出。
(最好將試管或離心管傾斜放置,使液面橫截面增大,能使血清更大程度的析出。)4℃1000*g離心20min,仔細收集上清。
建議將血清分裝多份,-20℃或-80℃保存,避免反復凍融。 采血過(guò)程中應避免溶血,因為紅細胞裂解時(shí)會(huì )釋放具有過(guò)氧化酶活性的物質(zhì),在以HRP為標記的ELISA檢測中會(huì )有非特異性的顯色,而導致檢測的不準確性。
同時(shí)也應避免細菌污染,因為菌體內可能含有內源性的HRP從而導致檢測的假陽(yáng)性。 血漿 用含抗凝劑的采血管或離心管采集血液標本,標本采集后30min內4℃1000*g離心15min,取上清即血漿。
將上清分裝多份,-20℃或-80℃保存,避免反復凍融。避免使用溶血或高血脂的標本。
常用的抗凝劑為EDTA、肝素鈉和枸櫞酸鈉等,檢測時(shí)還應仔細閱讀試劑盒說(shuō)明書(shū),檢查試劑盒是否對抗凝劑有特殊要求。 細胞培養上清 取細胞培養上清到離心管,1000*g離心20min,除去細胞碎片及雜質(zhì),取上清,-20℃或-80℃保存,避免反復凍融。
細胞裂解液 1) 吸去培養板內的培養基,用胰酶消化細胞,加適量培養基將細胞從培養板上吹下來(lái)。懸浮細胞可省略。
2) 收集細胞懸液,1000*g離心10min,棄去培養基,用預冷的PBS潤洗3次。 3) 加入適量的預冷PBS或細胞裂解液(臨用前加入蛋白酶抑制劑)重懸細胞。
通常6孔板一個(gè)孔的細胞量需要150~250μL PBS重懸。 4) 將樣品放入-20℃或-80℃,使樣品冷凍,再放室溫解凍樣品,反復凍融幾次,使細胞充分裂解。
也可將樣品進(jìn)行超聲破碎,以達到裂解的目的。 5) 4℃10000*g 離心10min,除去細胞碎片,取上清,-20℃或-80℃保存,避免反復凍融。
組織勻漿液 1) 將組織樣本用PBS (0.01M, PH 7.4) 沖洗,洗去組織表面殘留的血液或雜質(zhì)。 2) 將組織塊稱(chēng)重,記錄后剪碎,碎塊應盡量小,便于勻漿得更充分。
3) 將組織按一定的比例加入預冷的PBS(臨用前加入蛋白酶抑制劑)勻漿,勻漿時(shí)置于冰上或冰浴中。(通常按組織重量:PBS體積=1:9的比例勻漿,例如1g的組織樣本對應9mL的PBS,具體體積可根據實(shí)驗需要適當調整,檢測后計算樣品濃度時(shí)應乘以相應的稀釋倍數)。
4) 吸取勻漿液到離心管,4℃5000*g 離心5~10min,取上清,-20℃或-80℃保存,避免反復凍融。 尿液、唾液等其他液體生物樣本 1000*g離心20min,取上清即可檢測。
總的來(lái)說(shuō),因為ELISA只能檢測可溶性蛋白的含量,所以應保證所有樣本均為澄清的液體,沉淀或懸浮物都應離心去除。 為了保證檢測的準確性,保存于-20℃或-80℃的樣本最好在1~6個(gè)月內檢測;4℃保存的樣本應在1周內進(jìn)行檢測。
另外,還應保證樣本不含NaN3,因為NaN3會(huì )抑制HRP的活性,從而導致假陰性的結果。 試劑的準備 按試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求準備實(shí)驗中需用的試劑。
ELISA中用的蒸餾水或去離子水,包括用于洗滌的,應為新鮮的和高質(zhì)量的。自配的緩沖液、洗滌液應用pH計測量。
從冰箱中取出的試驗用試劑應待溫度與室溫平衡后使用,一般室溫平衡不低于30min。試劑盒中本次試驗不需用的部分應及時(shí)放回冰箱保存。
加樣 在ELISA中一般有3次加樣步聚,即加標本,加酶結合物,加底物。加樣時(shí)應將所加物加在LEISA板孔的底部,避免加在孔壁上部,并注意不可濺出,不可產(chǎn)生氣泡。
加標本一般用微量加樣器,按規定的量加入板孔中。每次加標本應更換吸嘴,以免發(fā)生交叉污染,也可用一次性的定量塑料管加樣(一般不建議使用)。
有些指標檢測(如間接法ELISA)需用稀釋的血清,可在試管中按規定的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔中加入稀釋液,再在其中加入血清標本,然后在微型震蕩器上震蕩1min。
加酶結合物工作液和底物工作液時(shí)可用多道移液器,使加液過(guò)程在最短時(shí)間內完成。 保溫 在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應,即加標本和加酶結合物后。
抗原抗體反應的完成需要有一定的溫度和時(shí)間,這一保溫過(guò)程稱(chēng)為溫育(incubation),有人稱(chēng)之為孵育。 ELISA屬固相免疫測定,抗原、抗體的結合只在固相表面上發(fā)生。
以抗體包被的夾心法為例,加入板孔中的標本,其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結合的機會(huì ),只有最貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個(gè)逐步平衡的過(guò)程,因此需。
ELISA標準曲線(xiàn)是結果計算的尺子,標準品是ELISA 實(shí)驗成功與否的關(guān)鍵點(diǎn)。怎樣正確溶解、稀釋標準品呢?
1. 粉末標準品短暫離心,讓因運輸沾到管蓋、管壁的標準品沉到管底。
2. 根據瓶標簽加入一定體積的蒸餾水,加水后輕柔渦旋震蕩,室溫靜置溶解 10-30min,讓粉末完全溶解。
注意:加水后暫不用移液槍吹吸,避免蛋白未溶解,槍頭帶出部分蛋白,待完全溶解后可吹吸或渦旋振蕩混勻。
3. 標準品梯度稀釋?zhuān)?/p>
(1)標準品稀釋液的選擇:
若血清、血漿、組織勻漿樣本,用試劑盒中的標準品稀釋液,梯度稀釋標準品。
若細胞上清樣本,建議用細胞培養基梯度稀釋標準品。
(2)耗材準備:準備8個(gè)1.5Ml離心管,寫(xiě)上S1-S7、空白。
(3)梯度稀釋?zhuān)焊鶕f(shuō)明書(shū),每管加入等體積的標準品稀釋液(培養基)。吸取同體積溶解好的標準品到S1管中,吹打10次混勻,渦旋5S。從S1管中吸取同體積溶液到 S2管,吹打10次混勻,渦旋5s。同法稀釋S3-S7濃度。
(4)空白: 標準品稀釋液(培養基)作為空白即零濃度。
注意:梯度稀釋標準品時(shí),渦旋震蕩混勻后可短暫離心,讓到蓋子、壁上的液體到管底,再開(kāi)始稀釋下個(gè)濃度。
標準品溶解、梯度稀釋是ELISA實(shí)驗關(guān)鍵點(diǎn),按以上方法梯度稀釋即可。
注意事項:
1.試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用,酶標包被板開(kāi)封后如未用完,板條應裝入密封袋中保存。
2.濃洗滌液可能會(huì )有結晶析出,稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶,洗滌時(shí)不影響結果。
3.各步加樣均應使用加樣器,并經(jīng)常校對其準確性,以避免試驗誤差。一次加樣時(shí)間最好控制在5分鐘內,如標本數量多,推薦使用排槍加樣。
4.請每次測定的同時(shí)做標準曲線(xiàn),最好做復孔。如標本中待測物質(zhì)含量過(guò)高(樣本OD值大于標準品孔第一孔的OD值),請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(n倍)后再測定,計算時(shí)請最后乘以總稀釋倍數(*n*5)。
5.封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。
6.底物請避光保存。
7.嚴格按照說(shuō)明書(shū)的操作進(jìn)行,試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準。
8.所有樣品,洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
9.不同批號組分不得混用。
Elisa實(shí)驗中應該注意的問(wèn)題,包括樣品稀釋、試劑盒平衡、樣品和試劑的混勻、加樣、溫育等問(wèn)題,希望對你有用處。
Elisa試劑盒有著(zhù)準確性高、靈敏度高、特異性強的諸多優(yōu)點(diǎn),深受廣大用戶(hù)朋友的喜愛(ài)。然而,在實(shí)驗過(guò)程中,也需要注意很多問(wèn)題。對此,武漢福來(lái)生物工程提醒你,需要遵守一些規則,才能更好地進(jìn)行實(shí)驗,取得較好的實(shí)驗成果。
Elisa方法被廣泛應用于各種抗原和抗體測定。在Elisa測定中影響因素較多,在檢測過(guò)程中除正常反應外,有時(shí)常見(jiàn)到一些錯誤的結果。引起ELISA測定錯誤結果的原因主要有:標本因素;試劑因素;操作因素。
1.樣品稀釋
一般產(chǎn)品的樣品稀釋倍數均通過(guò)大量試驗確定,以保證試驗的靈敏度和特異性。酶聯(lián)免疫反應是一種敏感性很高的反應,如果血清不稀釋?zhuān)豢杀苊鈺?huì )產(chǎn)生很強的非特異性反應,出現假陽(yáng)性。
2.試劑盒平衡
Elisa中所有試劑和板條均應在試驗前平衡至室溫(約25℃),一般需在室溫放置20~30分鐘以上。平衡時(shí)間太短會(huì )造成試劑混勻不夠,樣品孵育時(shí)間相對縮短,ELISA反應不夠充分。冬季室溫低,可將試劑盒置37℃溫箱20分鐘。
3.樣品和試劑的混勻
在稀釋前、后的樣品必須充分混勻,所有試劑在加樣前也須搖勻,以保證試驗的均一性。
4.加樣
加樣是一項很重要的步驟。加樣不可太快,要避免加在孔壁上部,不可濺出和產(chǎn)生氣泡。加樣太快,無(wú)法保證微量加樣的準確性和均一性。加在孔壁上部的非包被區,易導致非特異吸附。
5.溫育
溫育是ELISA測定中影響測定成敗最為關(guān)鍵的一個(gè)因素。ELISA作為一種固相免疫測定,抗原抗體的結合反應在固相上進(jìn)行,要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原完全結合,必須在一定的溫度條件下反應一定的時(shí)間。
6.洗板
固相免疫測定技術(shù)是一種非均相免疫測定技術(shù),需以洗滌操作將特異結合于固相的抗原或抗體與反應溫育過(guò)程中吸附的非特異成份分離開(kāi)來(lái),以保證ELISA測定的特異性。洗液盡量不要溢出孔外;加洗液后要靜置1分鐘,甩去板孔中洗液后,一定要大力拍干;及時(shí)更換吸水紙,尤其是拍過(guò)酶標記物的吸水紙一定要棄去,否則可能影響試驗結果。
7.顯色
顯色一定要控制時(shí)間,根據試劑盒說(shuō)明操作即可。一般來(lái)說(shuō),顯色時(shí)間過(guò)短,結果偏低;顯色時(shí)間過(guò)長(cháng),空白增高或者非特異性顯色增加。
8.比色
比色要注意波長(cháng)的選擇。以TMB為底物和以OPD為底物的試劑盒均有使用,而前者比色波長(cháng)為450nm,后者為492nm,濾光片需根據要求隨時(shí)更換。因此,容易出現濾光片錯用的問(wèn)題。
1.儲存。
收到試劑盒后應盡快放入冷藏室內保存,保存溫度為4℃-8℃。2.回溫。
試劑盒在使用前應于室溫(22-27℃)下充分回溫,回溫時(shí)間為40-60分鐘。回溫過(guò)程中勿將酶標板的包裝袋開(kāi)封,回溫結束后再將其從包裝袋中取出使用。
3.樣品稀釋。樣品稀釋?xiě)獓栏癜凑照f(shuō)明書(shū)要求的稀釋倍數進(jìn)行稀釋。
如稀釋倍數過(guò)大,可采用多步法進(jìn)行樣品稀釋。例如:試劑盒要求樣品需進(jìn)行500倍稀釋?zhuān)晌?μl樣品加入245μl樣品稀釋液中,充分混勻后,再吸取10μl混合液加入90μl樣品稀釋液中即可。
4.加樣。稀釋好的樣品在加入酶標板進(jìn)行孵育的過(guò)程中,盡可能縮短第一次加樣和最后一次加樣的時(shí)間間隔,樣品加好后馬上開(kāi)始計時(shí)。
5.洗板。樣品孵育時(shí)間結束后,馬上甩去孔內液體。
如多塊酶標板需同時(shí)洗滌,可先將板內液體甩去,倒扣于吸水紙上,再依次進(jìn)行洗滌。使用洗板機洗滌時(shí),建議洗滌次數增加一次。
未用完的洗滌液可在4℃-8℃下密封保存1月。6.顯色。
底物藥片可在顯色前3-5分鐘加入底物緩沖液中,混合直到完全溶解。本試劑最好是現用現配,未用完的底物溶液可在4℃-8℃下避光保存1周。
7.終止及讀數。提前打開(kāi)酶標儀,加入終止液后立即讀數。
8.同批號試劑盒中的試劑,除酶標二抗及陽(yáng)性對照外,其余均可通用。9.移液器的正確使用、保存、清潔、校對。
10.實(shí)驗室管理 桌面保持整潔,插槍頭戴手套等。
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