目前補體測定的方法(補體測定法)

1.補體有哪些測定法

(1)液相法：先將同位素標(biāo)記的C1q與滅活過的血清標(biāo)本混合作用，再加入0.5%（終濃度）的PEG將結(jié)合了C1q的CIC沉淀下來，通過檢測沉淀物中的放射活性來計算CIC的含量。

（2）固相法：先將C1q吸附于固相載體表面，加入待檢血清使CIC與C1q結(jié)合，再加入同位標(biāo)記的或酶標(biāo)記的抗人IgG或SPA，最后檢測其放射活性或酶活性。 （3）C1q偏離試驗：先將同位素標(biāo)記的C1q與滅活的血清標(biāo)本混合，再加抗體致敏的綿羊紅細胞，溫育后離心，檢測紅細胞上的放射活性。

紅細胞的放射活性與免疫復(fù)合物的量呈負相關(guān)。

2.如何檢測補體的存在

補體測定 第一節(jié) 補體的性質(zhì)與活化途徑 一、補體的性質(zhì) 補體（complement,C）：是一組存在于人和脊椎動物（vertebrates）血清及組織液中具有酶樣活性、不耐熱和功能上連續(xù)反應(yīng)的糖蛋白，是抗體發(fā)揮溶細胞作用的必要補充條件，故稱為補體。

補體系統(tǒng)的功能：廣泛參與機體的抗感染防御反應(yīng)，介導(dǎo)細胞溶解，調(diào)理吞噬，免疫黏附，參與炎癥反應(yīng)引起機體免疫損傷等 補體按其性質(zhì)與功能分為三類，即 ? ①補體系統(tǒng)的固有成分，共9種，按先后次序分別命名為C1-C9 ②調(diào)節(jié)和控制補體系統(tǒng)活化的成分，多以其功能命名，如C1抑制物 ③補體受體（CR），以其結(jié)合對象來命名 二、補體的活化途徑 經(jīng)典途徑 替代途徑 MBL途徑 （一）補體激活的經(jīng)典途徑 是以IgG(1,2,3)或IgM類抗體結(jié)合抗原后的免疫復(fù)合物為主要激活劑，激活過程從C1q開始，補體C1~C9共11種成分全部參與的活化途徑。二）補體激活的替代途徑 補體激活的替代途徑又稱旁路途徑，與經(jīng)典途徑不同之處在于激活與抗原體復(fù)合物 無關(guān)，是非特異性的，沒有c1,c4和c2參與，直接激活c3，完成c5~c9的激活過程 血清總補體活性測定（CH50試驗） （一）實驗原理 補體最主要的活性是溶細胞作用，這種活性很容易通過溶血反應(yīng)進行檢測。

在一個適當(dāng)?shù)?、穩(wěn)定的反應(yīng)系統(tǒng)中，溶血反應(yīng)對補體的劑量依賴呈一個特殊的S形曲線。在輕微溶血和接近完全溶血時，補體量的變化不能使溶血程度有顯著改變，即溶血對補體量的變化不敏感。

但在半溶血（50%溶血）上下時曲線最陡，即使補體含量僅有較小變動時，溶血程度也會發(fā)生較大的改變，也就是說對補體量的變化非常敏感。故采用50%溶血作為終點指標(biāo)要比100%溶血敏感得多，這一方法稱為補體50%溶血（complement hemolysis 50%），簡稱為CH50。

二）試驗方法1、綿羊RBC：濃度一般為2%~5%2、溶血素：即抗綿羊RBC抗體，試驗前應(yīng)在56℃加熱30min或60 ℃加熱30min以滅活補體3、稀釋緩沖液：磷酸緩沖液或巴比妥緩沖液4、50%溶血標(biāo)準(zhǔn)管：5、取新鮮血清標(biāo)本進行試驗。按的要求在各管中加入試劑和反應(yīng)物，一起放37℃水浴箱中溫育30min。

溫育后將所有試管2500r/min離心5min，通過觀察比較，選擇溶血程度與標(biāo)準(zhǔn)管相近的兩管在分光光度計上分別讀取吸光度，以最接近標(biāo)準(zhǔn)管的那一管定為最高有效反應(yīng)管，取其稀釋倍數(shù)代入下列公式，求得CH50的測定值（單位U）。每毫升血清總補體活性（單位）= 1/血清用量*稀釋倍數(shù) 三）方法評價 CH50試驗測定的是經(jīng)典途徑總補體溶血活性，所反應(yīng)的是補體9種成分的綜合水平。

方法簡便、快速，但敏感性低，補體的溶血活性除與試驗中反應(yīng)體積成反比外，還與反應(yīng)所用緩沖液的pH、離子強度、鈣鎂濃度、SRBC數(shù)量和反應(yīng)溫度有一定關(guān)系。鈣鎂離子可穩(wěn)定溶血系統(tǒng)，但過量反而抑制溶血反應(yīng)。

單個補體成分的測定 一、免疫溶血法 二、免疫化學(xué)法 補體結(jié)合試驗 補體結(jié)合試驗（complement fixation test,CFT）是用免疫溶血機制做指示系統(tǒng)，來檢測另一反應(yīng)系統(tǒng)抗原或抗體的試驗。早在1906年Wasermann就將其應(yīng)用于梅毒的診斷，即著名的華氏反應(yīng)。

這一傳統(tǒng)的試驗經(jīng)不斷改進，除了用于傳染病診斷和流行病學(xué)調(diào)查以外，在一些自身抗體、腫瘤相關(guān)以原以及HLA的檢測和分析中也有應(yīng)用。一、試驗原理 該試驗中有5種成分參與反應(yīng)，分屬于3個系統(tǒng)： ①反應(yīng)系統(tǒng)，即已知的抗原（或抗體）與待測的抗體（或抗原）；②補體系統(tǒng)；③指示系統(tǒng)，即SRBC與相應(yīng)溶血素，試驗時常將其預(yù)先結(jié)合在一起，形成致敏紅細胞。

反應(yīng)系統(tǒng)與指示系統(tǒng)爭奪補體系統(tǒng)，先加入反應(yīng)系統(tǒng)給其以優(yōu)先結(jié)合補體的機會。二、試驗方法 補體結(jié)合試驗的改良方法較多，較常用的有全量法（3ml）、半量法（1.5ml）、小量法（0.6ml）和微量法（塑板法）等。

目前以后兩種方法應(yīng)用較為廣泛，因為可以節(jié)省抗原，血清標(biāo)本用量較少，特異性也較好。以下敘述以小量法為例，即抗原、抗體、溶血素、羊紅細胞各加0.1ml，補體加0.2ml，總量為0.6ml。

（一）試劑1.抗原：試驗中用于檢測抗體的抗原應(yīng)適當(dāng)提純，純度愈高，特異性愈強。如使用粗制抗原時，須經(jīng)同樣處理的正常組織作抗原對照，以識別待檢血清中可能存在的、對正常組織成分的非特異性反應(yīng)。

2.抗原和抗本的滴定：補體結(jié)合試驗中，抗原與抗體按一定比例結(jié)合，因而應(yīng)通過試驗選擇適宜的濃度比例。多采用方陣法進行滴定，選擇抗原與抗體兩者都呈強陽性反應(yīng)（100%不溶血）的最高稀釋度作為抗原和抗體的效價（單位）。

3、補體的滴定：一般用豚鼠補體，補體滴定9逐步加入各試劑，溫育后觀察最少量補體能產(chǎn)生完全溶血者，確定為1個實用單位，正式試驗中使用2個實用單位。（二）血清標(biāo)本 采集血液標(biāo)本后及時分離血清，及時檢驗或?qū)⒀灞４嬗?20℃。

血清在試驗前應(yīng)先加熱56℃30min（或60℃3min）以破壞補體和除去一些非特異因素。血清標(biāo)本遇有抗補本現(xiàn)象時可做下列處理之一：①加熱提高12 ℃ ；②-20℃凍融后離心去沉淀；③以3mmol/L鹽酸處理；④加入少量補體后再加熱滅活；⑤以白陶土處理；⑥通入CO2；⑦以小白鼠肝粉處理；⑧用含10%新鮮雞蛋。